Calderón de la Barca 54 2 d San Vicente del Raspeig 03690 Alicante- España
965992104

Se debe erradicar el concepto de alcalinización=mejoría de las micosis

La adaptación de Candida albicans al pH ambiental acido induce la remodelación de la pared celular y mejora el reconocimiento inmune innato

Resumen

Candida albicans puede proliferar en entornos que varían drásticamente en el pH ambiental, un rasgo requerido para colonizar nichos como el estómago, la mucosa vaginal y el tracto gastrointestinal. Aquí mostramos que el crecimiento en entornos ácidos implica la remodelación de la pared celular que da como resultado una exposición mejorada a quitina y β-glucano en la periferia de la pared celular. Desenmascaramiento de la inmuno-estimuladoras β-glucano subyacente en ambientes ácidos mejorada reconocimiento inmune innato de C . albicanspor macrófagos y neutrófilos, e indujo una respuesta de citocina proinflamatoria más fuerte, impulsada a través del receptor tipo lectina tipo C, Dectin-1. Esta respuesta inflamatoria mejorada resultó en un reclutamiento significativo de neutrófilos en un modelo de infección intraperitoneal, un sello distintivo de la colonización vaginal sintomática. La exposición a quitina mejorada resultó de la expresión reducida de la quitinasa Cht2 de la pared celular, a través de una cascada de señalización dependiente de Bcr1-Rim101, mientras que la exposición aumentada a β-glucano se reguló a través de una vía de señalización no canónica. Proponemos que este “desenmascaramiento” de la pared celular puede inducir una hiperactivación no protectora del sistema inmune durante el crecimiento en nichos ácidos, y puede atribuirse a una infección vaginal sintomática.

Resumen del autor

Para poder colonizar un huésped o causar infección, los microbios deben poder adaptarse y responder a los cambios en su entorno. Una de las señales ambientales más importantes para los agentes patógenos oportunistas es pH ambiente, con cambios en el pH externo resultantes en fenotípica, metabólicas y cambios físicos en hongos y bacterias (es decir, E . Coli , Salmonella , Aspergillus , Candida ). Candida albicansEs un patógeno fúngico oportunista de los humanos que puede colonizar e infectar nichos de pH variable, incluida la mucosa ácida de la vagina. Aquí mostramos que el crecimiento en un ambiente ácido da como resultado una modificación estructural de la pared celular fúngica, una clave dinámica de orgánulos para el reconocimiento inmune. Estas perturbaciones de la pared celular dieron como resultado un reconocimiento inmune mejorado del patógeno fúngico, una fuerte respuesta inmune proinflamatoria y un reclutamiento mejorado de neutrófilos. Por lo tanto, la colonización de la mucosa ácida puede desenmascarar los componentes de la pared celular que desencadenan la hiperactivación de la respuesta inmune innata y podrían contribuir a la inmunopatología asociada con la candidiasis vaginal.

Introducción

El patógeno fúngico oportunista Candida albicans es un comensal en hasta el 80% de la población, y puede causar infecciones superficiales de la mucosa en individuos sanos [  ,  ] y enfermedad invasiva en pacientes inmunodeprimidos [  ,  ]. Las infecciones de la mucosa aumentan la morbilidad de la población y son caras de tratar, mientras que la enfermedad diseminada se asocia con altas tasas de mortalidad [  , ].

Un atributo de C . Albicans que lo ha convertido en un patógeno oportunista tan exitoso es su capacidad de adaptarse y proliferar en una amplia gama de entornos host. Una de las condiciones ambientales más importantes que fluctúan entre diferentes nichos es el pH ambiental. C . albicans es capaz de crecer en medios que van desde pH 2 a pH 10, y C . Albicans se ha aislado de una variedad de sitios anatómicos que varían drásticamente en el pH ambiental, incluido el estómago (pH2) [  ], la vagina (pH4-5) [  ] y la mucosa oral (pH6) [  ], lo que sugiere que la adaptación a El pH ambiental es clave para la patogenicidad deC . albicans . Adaptación de C . albicans a ambientes ácidos regula procesos biológicos clave, incluida la morfogénesis [  ], el cambio de blanco a opaco y el apareamiento [  ]. Sin embargo, el impacto que tiene la adaptación ambiental en la estructura y composición de la pared celular fúngica, el primer punto de contacto entre el hongo y el huésped, no está bien definido.

La pared celular fúngica es una estructura compleja de varias capas de manoproteínas, β-glucanos y quitina que proporciona rigidez y forma y protege al hongo del medio ambiente [  ]. Estos motivos de proteínas y carbohidratos son inmunogénicos y juegan papeles importantes en el reconocimiento inmune innato [ ]. La adaptación ambiental influye en el proteoma de la pared celular e impacta en la estructura de los glicanos que decoran las proteínas de la pared celular [  ]. Por ejemplo, el crecimiento en los medios sanguíneos o de lactato disminuye la complejidad estructural de las fibrillas de manano externas [  –  ], mientras que el tratamiento con medicamentos antimicóticos influye en la exposición al β-glucano [  , ] Los cambios estructurales en la pared celular, como resultado de la mutación en enzimas clave del ensamblaje de la pared celular glucolítica, confirman que la modulación de la pared celular tiene profundas implicaciones para el reconocimiento inmune innato [  ]. Por lo tanto, entender cómo la adaptación ambiental impacta en la biogénesis de la pared celular y la consecuencia que esta remodelación de la pared celular tiene en el reconocimiento inmune innato es un área importante, pero poco estudiada, de la biología fúngica. Aquí, investigamos cómo la adaptación a ambientes ácidos que imitan el pH de la mucosa vaginal impacto sobre la estructura y composición de la C . albicans pared celular y deducir cómo esta remodelación de la pared celular afecta el reconocimiento inmune innato del patógeno.

Resultados

El crecimiento en ambientes ácidos altera la ultraestructura de la pared celular fúngica

El impacto de la adaptación al pH ambiental en la ultraestructura de la pared celular se investigó mediante microscopía electrónica de transmisión. Se tomaron imágenes de la pared celular de las células de levadura de fase media logarítmica cultivadas en YPD tamponado a pH2, pH4, pH6, pH8 y YPD estándar. Bajo todas las condiciones probadas, la pared celular mantuvo dos capas distintas: una capa interna compuesta de glucano y quitina, y una capa externa fibrilar de manoproteínas. Sin embargo, la adaptación a las condiciones ácidas resultó en una pérdida significativa de organización estructural en la pared celular externa, que parecía ser menos fibrilar ( Fig. 1A) La cuantificación del grosor de la capa de la pared celular exterior confirmó que la adaptación a ambientes ácidos redujo significativamente la longitud de la fibrilla de manano (pH2 23.23 ± 3.58 nm (p = 0.0001), pH4 39.49 ± 4.61 nm (p = 0.0495), en comparación con pH6 60.22 ± 10.73 nm; Fig. 1B ). Presumimos que esta pérdida de estructura fibrilar podría deberse a cambios en la arquitectura subyacente de la pared celular. Por lo tanto, investigamos si el pH influye de manera similar en la estructura de la quitina.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g001.jpg

La adaptación al pH ambiental altera la ultraestructura de la pared celular fúngica.

a) Micrografías electrónicas que muestran la ultraestructura de las paredes celulares de tipo C salvaje . albicans (NGY152) crecido hasta la fase de registro medio en YPD tamponado al pH apropiado. La barra de escala representa 100 nm. b) Cuantificación del grosor de la capa interna de la pared celular y la longitud de fibrilla de la manoproteína. Los datos representan la media ± SEM de 5 células individuales. Cada célula se midió en 30 puntos diferentes alrededor de la periferia celular (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).

Los ambientes ácidos inducen la reorganización de la pared celular fúngica a través de la modulación de la quitina.

Aunque quitina sólo forma una pequeña fracción de la pared celular fúngica (3-5% en peso seco), un mecanismo de compensación importante de C . Albicans al estrés de la pared celular es regular la síntesis de quitina para aumentar la integridad de la pared celular [  ]. Para identificar si la desorganización observada en la capa de la pared celular externa fue el resultado de una mayor incorporación de quitina, la pared celular de las células adaptadas ácidas se tiñó con Calcofluor White (CFW). La cuantificación de la fluorescencia CFW indicó que el contenido de quitina de la pared celular solo se elevó a pH 2 ( Fig. 2A ), un resultado que fue confirmado por HPLC ( Tabla 1), lo que sugiere que la adaptación a entornos de pH muy bajo requiere la síntesis de quitina. Sin embargo, la tinción de la pared celular con aglutinina de germen de trigo (WGA), una lectina que une la quitina expuesta a la superficie, indicó que incluso la adaptación al pH 4 requirió la reorganización de la quitina de la pared celular, con quitina cada vez más expuesta durante la adaptación al pH ácido ( Fig. 2B ). La microscopía confirmó que las células adaptadas al pH ácido mostraron un importante desenmascaramiento de quitina alrededor de la periferia celular, con una intensa tinción de WGA en las cicatrices de las yemas a pH 2 ( Fig. 2C ). Para deducir si este fenómeno de desconexión es un proceso activo, analizamos la eliminación de la quitina en respuesta al pH en las células muertas. El desacoplamiento de la quitina de la pared celular solo se produjo en células vivas ( S1 Fig.), confirmando que el aumento observado en la exposición superficial de quitina no fue un efecto físico del pH simplemente degradando la pared celular. Por lo tanto, la adaptación a entornos ácidos es un proceso de dos etapas con entornos ácidos moderados (pH 4) que provocan el desenmascaramiento activo de la quitina y entornos ácidos fuertes (pH2) que inducen la síntesis de novo de quitina y un mayor desenclavamiento de la qu

La adaptación a ambientes ácidos promueve la exposición superficial de quitina.

a) Se hicieron crecer células de tipo salvaje (NYG152) en YPD tamponado al pH apropiado, se tiñeron con CFW y se cuantificó la fluorescencia por FACS. El aumento de veces en la tinción de CFW se determinó a partir de los valores de MFI sustraídos de fondo del análisis FACS, y se normalizó a células crecidas con YPD. b) Aumento del doblez en la fluorescencia de FITC de células de tipo salvaje teñidas con FITC-WGA (NYG152) crecidas a pH diferente, en relación con el crecimiento en YPD tal como se cuantificó mediante análisis FACS. Todos los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. c)Microscopía de células teñidas con WGA. Las puntas de flecha indican exposición a quitina. Barra de escala = 10 μm.

tabla 1

Proporciones relativas en peso seco (%) de glucano y quitina en la pared celular cuantificadas por HPLC.
Condición Quitina Glucano
pH2 21,11 (± 3,71) 78,89 (± 3,71)
pH4 10,69 (± 9,77) 89,31 (± 9,77)
pH6 7,97 (± 0,83) 87,26 (± 7,58)
pH8 7,73 (± 5,42) 88,02 (± 0,51)

Ni Mkc1, Hog1 ni Crz1 regulan la exposición a la quitina en respuesta al estrés de pH moderado

La síntesis de quitina está regulada por la recuperación de la pared celular, las vías de señalización de calcio / calcineurina y glicerol de alta osmolaridad (HOG) [  ]. Para evaluar si estas vías están involucradas en la reorganización de la quitina, se determinó la activación de estas cascadas de señalización en respuesta al pH ambiental. Hog1 no se activó durante el crecimiento exponencial en entornos de pH diferente ( Fig. 3A ). De acuerdo con esto, la eliminación de HOG1 no tuvo impacto en la exposición superficial de quitina durante la adaptación a entornos de pH 4 ( Fig. 3B ). Aunque la vía de recuperación de la pared celular se activó en respuesta a ambientes ácidos ( Fig. 3C ), la eliminación de MKC1 y RLM1no impidió la remodelación de la pared celular que da como resultado el desenmascaramiento de la quitina subyacente ( Fig. 3B y 3D ). La eliminación de CRZ1 , el factor de transcripción aguas abajo de la vía del calcio / calcineurina, tampoco tuvo impacto en la exposición a la quitina en el ácido C adaptado . células albicans ( Fig. 3D ). Por lo tanto, estas vías no están involucradas en la reorganización de la quitina durante la adaptación a ambientes de pH 4.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g003.jpg

Mkc1, Hog1 y Crz1 no son necesarios para la eliminación de la capa de quitina en respuesta al pH ácido.

a) A C . La cepa de albicans que expresaba Hog1-GFP se cultivó en YPD tamponado al pH apropiado durante 4 hy la localización (citoplasmática frente a nuclear) de Hog1 se puntuó en 200 células por condición. Como control positivo de la activación de Hog1, las células cultivadas en YPD se incubaron con NaCl 1 M durante 30 minutos antes de la obtención de imágenes. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. b) Aumento de la tinción de WGA y CFW en mutantes de quinasa cultivados a pH 4 en relación con YPD según cuantificado por análisis FACS. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. DAY286 es la cepa control de los padres de los dos quinasa mutantes c) de tipo salvaje C . albicans(NGY152) se hizo crecer hasta la mitad de la fase logarítmica en YPD tamponado al pH apropiado, se extrajo la proteína total y se evaluó la activación de Mkc1 y Cek1 mediante transferencia Western usando el anticuerpo MAPK p42 / p44 que reacciona de forma cruzada con ambas quinasas. La flecha indica Mkc1, mientras que la punta de flecha indica Cek1. d) Aumento de la tinción de WGA y CFW en mutantes del factor de transcripción a pH 4 en relación con YPD según se cuantificó mediante análisis FACS. SN152 es la cepa de control parental de los dos mutantes del factor de transcripción. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes.

Rim101 y Bcr1 coordinan la localización correcta de quitina en la pared celular mediante la regulación de Cht2

La quitina se puede remodelar en la pared celular a través de las acciones de cuatro quitinasas (Cht1-4) [ ]. Por lo tanto, se determinó el papel de estas enzimas quitinasas en el desacoplamiento de quitina en respuesta al pH ambiental. La eliminación de CHT2 dio como resultado una mayor exposición a la quitina a pH 6 ( Fig. 4A ) en comparación con las cepas de control parental. Para determinar si la expresión de CHT2 está regulada por el pH ambiental, se realizó una RT-PCR semicuantitativa. La expresión de CHT2se reprimió en entornos ácidos en comparación con entornos de pH 6 o pH 8 ( Fig. 4B ). El perfil transcripcional a gran escala sugiere que la expresión de CHT2 depende en gran medida del factor de transcripción Bcr1 [ ]. Para confirmar esto, se determinó la expresión de CHT2 en una cepa mutante bcr1La expresión de CHT2 se redujo significativamente en el mutante bcr1 en todas las condiciones de pH analizadas ( Fig. 4C ), confirmando un papel dominante para Bcr1 en la expresión de CHT2 .

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g004.jpg

El enmascaramiento de quitina en la pared celular está regulado por Rim101 y Bcr1 y requiere Cht2.

a) Se cultivaron las cepas respectivas en YPD tamponado a pH 4 o pH 6 a la mitad de la fase logarítmica, se fijaron las células, se tiñeron con FITC-WGA y se cuantificó la fluorescencia mediante FACS. b) Se hizo crecer SC5314 hasta la mitad de la fase logarítmica en YPD tamponado a pH 4, pH 6 y pH 8, se congeló rápidamente y se extrajo el ARN total. La expresión de CHT2 se determinó por RT-PCR semicuantitativa utilizando 50 ng de ARN total. Los niveles de expresión se normalizaron a ACT1 . c) Expresión relativa de CHT2 en rim101 Δ y bcr1 Δ mutantes crecimiento exponencialmente en YPD tamponado a pH4, pH6 y pH8 y determinado por RT-PCR semicuantitativa. Los niveles de expresión se normalizaron a ACT1 . re)Análisis FACS de tinción WGA en mutantes rim101 Δ y bcr1 Δ. e) Análisis FACS de la tinción WGA en CARP1-1 que expresa Rim101 constitutivamente activo. f) Análisis FACS de la tinción WGA en mutantes she3 Δ. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. (**** p <0.0001, *** p <0.001, ** p <0.01, * p <0.05).

Para investigar el mecanismo por el cual CHT2 se reprime durante la adaptación a entornos ácidos, nos centramos en el factor de transcripción Rim101. Rim101 ha demostrado previamente que regula la expresión de las enzimas modificadoras de la pared celular Phr1 y Phr2 en respuesta al pH ambiental [  ], se ha implicado en la reorganización de la pared celular [  ] y es un activador de la expresión génica en entornos alcalinos [  ] La expresión de CHT2 se reprimió en el mutante rim101 Δ en entornos por encima de pH6 ( Fig. 4C ), con niveles de expresión de CHT2 a pH6 o pH8 comparables a pH4, lo que sugiere que Rim101 es un activador dependiente del pH deExpresión CHT2 . La expresión alcalina inducida de CHT2dependía de Bcr1, ya que los niveles de CHT2 permanecen bajos en todas las condiciones de pH en el mutante bcr1 Δ ( Fig. 4C ).

Para determinar cómo la desregulación de la expresión de CHT2 afecta la exposición a la quitina, los mutantes bcr1 Δ y rim101 Δ se cultivaron en YPD tamponado a pH4 y pH6, y se tiñeron con WGA. La eliminación de BCR1 resultó en una mayor exposición a la quitina a pH 6 (p = 0.0076) y pH4 (p = 0.0491), pero mantuvo cierta dependencia del pH, mientras que la eliminación de RIM101 resultó en una exposición constitutivamente alta a la quitina ( Fig. 4D ). Para investigar si la expresión de Rim101 a pH 4 afectaría el fenotipo, cuantificamos la exposición a quitina en una cepa que expresa Rim101 constitutivamente activo (CARP1-1). El análisis FACS confirmó que la expresión de Rim101 activo en ambientes ácidos redujo la exposición a quitina ( Fig. 4E), pero aún era insuficiente para enmascarar completamente la quitina. Estos resultados confirman que Rim101 juega un papel importante en la regulación de los genes de la pared celular fundamentales para corregir la incorporación de quitina.

El ARNm de CHT2 es un objetivo de She3, que transporta ARNm a la pared celular [  ]. Por lo tanto, determinamos si este complejo también es necesario para la correcta incorporación de quitina en la pared celular. La eliminación de SHE3 dio como resultado un mejor desenmascaramiento de quitina en entornos por encima de pH4 ( Fig. 4F ), similar a los mutantes cht2 Δ y bcr1 Δ. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la incorporación de quitina en la pared celular interna a pH 6 está regulada por Rim101 y Bcr1 y requiere el suministro de Cht2 dependiente de She3 a la pared celular, mientras que el crecimiento en un ambiente ácido inactiva esta vía que conduce a una reducción de CHT2 expresión y mayor exposición de quitina en la superficie celular.

El pH bajo promueve el desenmascaramiento del β-glucano subyacente

El β-glucano es un componente principal de la pared celular, que es altamente inmunoestimulante y, en consecuencia, normalmente está enmascarado por una capa densa de proteínas glicosiladas. Como resultado, las células fúngicas tienen un grado de resistencia a las glucanasas extracelulares, que rompen la pared celular y causan lisis celular. Por lo tanto, la sensibilidad de C . albicans a β-glucanase recombinante se puede utilizar como una medida indirecta de la exposición a β-glucan [  ]. Crecimiento de C . albicansen ambientes ácidos mejora la sensibilidad a la β-glucanasa ( Fig. 5Ai y ii) en comparación con las células cultivadas con pH 6 o pH 8, lo que sugiere que el β-glucano es más accesible en células cultivadas en medios tamponados a pH 4. De acuerdo con esto, la tinción inmunofluorescente de la pared celular con un anticuerpo monoclonal β1,3-glucano reveló una tinción mejorada alrededor de la periferia de la pared celular ( Fig. 5B ). La cuantificación de la tinción inmunofluorescente por FACS reveló que las células adaptadas al ácido tenían casi 4 veces más β-glucano expuesto a la superficie ( Fig. 5C) que las células cultivadas en medios YPD, lo que sugiere que la adaptación a entornos ácidos induce el desenmascaramiento de β-glucano. Para descartar la posibilidad de que el pH simplemente degrade la pared celular, exponiendo el β-glucano subyacente, las células muertas se expusieron a YPD a pH 2, 4 y 6 durante 4 hy la exposición en la superficie se cuantificó por FACS. Solo las células vivas desenmascararon su β-glucano en respuesta al pH ácido ( Fig. S1 ), lo que confirma que, al igual que la exposición a la quitina, el desenmascaramiento de β-glucano es un proceso activo.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g005.jpg

Ambientes ácidos desenmascaran β-glucano en C . albicans .

ai) de tipo salvaje C . Albicans (NGY152) se hizo crecer hasta la mitad de la fase logarítmica en YPD tamponado al pH apropiado, y se incubó con β1,3-glucanasa recombinante. La disminución de OD 600representa la lisis celular cuando la β1,3-glucanasa digiere la pared celular y se expresa como un porcentaje de la OD 600 inicial . ii) La tasa inicial de lisis celular calculada a partir de los primeros 100 min. Los datos representan la media ± SEM de cuatro repeticiones independientes b) Imágenes inmunofluorescentes de la exposición a β-glucano de células NGY152 en crecimiento exponencial utilizando un anticuerpo monoclonal anti-β1,3-glucano. Barra de escala = 10 μm. do)Cuantificación de la exposición a β-glucano por FACS contando 10,000 eventos por repetición. El aumento de pliegue es relativo al YPD sin búfer. Los datos representan la media ± SEM de seis experimentos independientes. d) Cuantificación de la tinción con azul de anilina de células NGY152 que crecen exponencialmente mediante análisis FACS contando 10.000 eventos por repetición. El aumento de pliegue es relativo al YPD sin búfer. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. e) la exposición β-glucano de clínica C . los aislados de albicans crecidos hasta la mitad de la fase logarítmica en YPD tamponados a pH 4 en relación con YPD. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes (* p <0.05).

Para determinar si se requería la síntesis de β-glucano para este efecto de desenmascaramiento, se cuantificaron los niveles totales de glucano tiñendo las células con azul de anilina. La unión del azul de anilina a la pared celular fúngica fue consistente en todas las condiciones de pH, lo que sugiere que los niveles totales de β-glucano se mantuvieron constantes ( Fig. 5D ). Además, el análisis por HPLC confirmó que la cantidad de glucosa en la pared celular no era significativamente diferente en las células cultivadas en medios tamponados a diferentes pH ( Tabla 1 ). Por lo tanto, el aumento en la exposición a β-glucano ocurre como resultado de la remodelación de la pared celular y no a la síntesis mejorada de β-glucano.

Para deducir si des-encubrimiento de la pared celular fue una respuesta de adaptación general de C . albicans , se examinó la reorganización de la pared celular dependiente del pH de una serie de aislados clínicos de diferentes sitios y tipos de infección. Todos los aislamientos clínicos desacubrieron su pared celular en respuesta a ambientes ácidos ( Fig. 5E ), lo que confirma que este fenómeno no se limita a las cepas evolucionadas en laboratorio.

Para investigar si la forma de ácido utilizada para pH de los medios afecta al desenmascaramiento, se tamponó el medio YPD usando ácido láctico, un ácido orgánico producido por Lactobacilli durante la colonización de la mucosa vaginal. El crecimiento en YPD amortiguado a pH 4 con ácido láctico todavía indujo el desenmascaramiento de la pared celular, similar a la reducción del pH con HCl ( Fig. 6A ). Por lo tanto, los ácidos fisiológicamente relevantes impulsan el desenmascaramiento de la pared celular de una manera dependiente del pH. Con el fin de determinar si los entornos que imitan más estrechamente el entorno del tracto reproductivo femenino inducen remodelación de la pared celular, C . albicans se cultivó en medios de simulación vaginal (VSM) tamponados a pH 4, pH 6 o pH 7. C . albicansdesenmascararon significativamente más β-glucano (p = 0.0022) cuando el VSM fue amortiguado a pH4 que pH6 o pH7 ( Fig. 6B ), lo que sugiere que el ambiente dentro del tracto reproductivo femenino tiene el potencial de inducir la exposición de β-glucano. Debido a que se conocen los sitios de infección a contener una mezcla de levadura y células de hifas, C . Las hifas de albicans se generaron en medios ácidos en concentraciones elevadas de dióxido de carbono, un potente inductor de morfogénesis [  ] y en presencia de células epiteliales vaginales. Tanto las células de levadura como las hifas mostraron una mayor exposición a quitina y β-glucano en comparación con sus respectivos controles ( Fig. 6C y 6D) Por lo tanto, tanto las células de levadura como las hifas se someten a la remodelación de la pared celular durante la adaptación a ambientes ácidos, lo que resulta en la exposición superficial de β-glucano.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g006.jpg

La remodelación de la pared celular dependiente del pH ocurre en respuesta a ácidos fisiológicamente relevantes y no se limita a las células de levadura.

a) C . Se cultivaron células albicans (NGY152) en YPD, o YPD tamponado a pH 4 mediante la adición de HCl o ácido láctico a la fase de registro medio, fijado con 4% de PFA, teñido para exposición a β-glucano y quitina y intensidad de fluorescencia cuantificada por FACS. Los datos representan la media ± SEM de tres repeticiones independientes (**** p <0,0001). b) C . Se cultivaron células de albicans (NGY152) en medio de secreción vaginal (VSM) tamponado a pH 4, pH 6 o pH 7 durante 4 h, fijado, teñido para β-glucano e intensidad de fluorescencia cuantificada por FACS. Los datos representan la media ± SEM de seis repeticiones independientes (**** p <0.01). c) C . albicansLas células (NGY152) se cultivaron en placas de 24 pocillos en YPD tamponado a pH 4 y pH 6, DMEM tamponado a pH 4 y pH 6 a 37 ° C, 150 rpm, o crecieron en DMEM tamponado a pH 4 o pH 6 con 5% de CO 2 en presencia o ausencia de células epiteliales vaginales A431 durante 4 h. Las células se fijaron en PFA al 4% y se tiñeron para exposición a β-glucano yd) quitina. Los resultados son un aumento de veces con respecto al pH 6. Los datos representan la media ± SEM de tres repeticiones independientes.

Como la adaptación al pH ácido dio como resultado una exposición superficial de la quitina y el glucano, investigamos si estos carbohidratos quedaron expuestos en el mismo punto o en diferentes puntos de la pared celular. Las imágenes inmunofluorescentes dobles con TRITC-WGA y FITC-glucano confirmaron que, si bien la exposición a la quitina se produjo principalmente en cicatrices de brotes a pH 4 con un aumento de la exposición en la pared celular lateral a pH 2, la exposición a glucanos se localizó continuamente para puntear parches alrededor de la periferia celular ( Fig. 7 ) Como los carbohidratos expuestos no se ubicaron conjuntamente, planteamos la hipótesis de que no son dependientes entre sí y pueden regularse mediante diferentes procesos.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g007.jpg

La exposición de β-glucano y quitina no se localiza conjuntamente.

Se cultivaron células de Candida albicans de tipo salvaje (NGY152) hasta la mitad de la fase logarítmica en YPD tamponado a pH2, pH4 y pH6, se lavaron, se fijaron con PFA al 4% y se tiñeron con CFW, WGA marcado con TRITC y Fc-Dectin-1 (FITC ) Las puntas de flecha blancas indican parches de exposición a β-glucano. La barra de escala representa 10 μm.

Una hipótesis potencial para explicar la respuesta de desenmascaramiento al pH ácido es que la escisión química del fosfomanano externo podría reducir la complejidad del manano y dar como resultado un escudo de manano externo más poroso, permitiendo el acceso a las capas subyacentes de la pared celular. Para probar esta hipótesis , se examinó la exposición a carbohidratos después de la adaptación al pH ácido en el mutante mnn4 Δ, que carece de fosfomanano [  ]. El mutante mnn4 Δ deshizo su pared celular de manera similar a la cepa de control parental ( S2 Fig ), lo que sugiere que este fenómeno no es el resultado de la pérdida del fosfomanano y probablemente implica una reorganización activa activa de la pared celular.

Candida tropicalis también desenmascara el β-glucano en respuesta al pH ácido

Para determinar si desenmascaramiento de β-glucano es específico de C . albicans , se evaluó el impacto de los ambientes ácidos en especies de Candida no albicans y en Saccharomyces cerevisiae . En marcado contraste con C . albicans , el crecimiento en condiciones ácidas reduce la sensibilidad de S . cerevisiae a? 1,3-glucanasa, lo que sugiere que en respuesta a ambientes ácidos S . cerevisiae enmascara su β-glucano ( Fig. 8 ), que se ha informado previamente [  ]. Asimismo, parapsilosis por Candidatambién mostró una leve, estadísticamente insignificante, disminuyó sensiblemente a la β1,3-glucanasa cuando se cultivó en condiciones ácidas ( Fig. 8 ). Por otro lado, Candida glabrata y Candida dubliniensis no mostraron ninguna modulación dependiente del pH de la exposición a β-glucano ( Fig. 8 ). Inesperadamente, Candida krusei desenmascaró su β-glucano en respuesta a ambientes alcalinos ( Fig. 8 ), mientras que Candida tropicalis desenmascaró su β-glucano en respuesta a pH bajo ( Fig. 8 ). Por lo tanto, de los aislados examinados solamente C . albicans y C . tropicalis desenmascarar β-glucano en respuesta a pH bajo.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g008.jpg

Desenmascaramiento de β-glucano en respuesta a pH ambiental es específico de C . albicans y C. tropicalis .

a) Las células que crecen exponencialmente en YPD, YPD tamponado a pH 4 y YPD tamponado a pH 8 se incubaron con β1,3-glucanasa recombinante. La disminución de OD 600 representa la lisis celular cuando la β1,3-glucanasa digiere la pared celular y se expresa como un% del OD 600 inicial . Los datos representan la media ± SEM de cuatro experimentos independientes. b) La tasa inicial de lisis celular se calculó a partir de los primeros 100 minutos después de la adición de β-glucanasa. Los datos representan la media ± SEM de cuatro repeticiones independientes (* p <0.05, ** p <0.01).

Desenmascarar β-glucano implica una vía de remodelación de la pared celular no canónica

La investigación de las principales vías de transducción de señales que se sabe que están involucradas en la remodelación de la pared celular (es decir, Mkc1, Hog1, Crz1) confirmó que estas vías no son necesarias para el desenmascaramiento de β-glucano dependiente del pH ( Fig . S3 ). Debido a la participación de Rim101 y Bcr1 en la eliminación de la capa de quitina, planteamos la hipótesis de que estos factores de transcripción también pueden estar involucrados en el desenmascarado de β-glucano. Sin embargo, los mutantes rim101 Δ y bcr1 Δ todavía desenmascaran β-glucano de una manera dependiente del pH ( S3 Fig). Como Rim101 no se somete a procesamiento C-terminal a pH ácido, también se evaluó el desenmascaramiento de β-glucano en una cepa que expresa constitutivamente Rim101 activo (CARP1-1). La cepa CARP1-1 todavía mostraba un desenmascaramiento de β-glucano dependiente del pH ( Fig. S3), lo que sugiere que la cascada de señalización Rim101 no es necesaria para el enmascaramiento de β-glucano dependiente del pH. Por lo tanto, mientras Rim101 / Bcr1 regula la exposición a la quitina, una vía de señalización no canónica regula el desenmascarado de β-glucano dependiente del pH.

Acid adaptado C . las células de albicans se fagocitan fácilmente e inducen una fuerte respuesta inmune innata

La pared celular es el primer punto de contacto entre el hongo y el sistema inmune del huésped y, por lo tanto, la pared celular juega un papel importante en el reconocimiento inmune innato de los hongos. Por lo tanto, se investigó el papel de la eliminación de la pared celular dependiente del pH en la regulación de las respuestas inmunes innatas. C . albicans células cultivadas en medios ácidos fueron fagocitadas más fácilmente por macrófagos y neutrófilos que C . células de albicans cultivadas en medio YPD estándar ( Fig. 9A y 9B ).

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g009.jpg

La adaptación a ambientes ácidos aumenta el reconocimiento inmune.

C . albicans se cultivó en YPD al pH apropiado para la fase de registro medio, se incubó conjuntamente con a)macrófagos J774.1A b) neutrófilos a una MOI = 5 durante 1 hy se determinó la tasa de fagocitosis. Los datos representan la media ± SEM de cuatro repeticiones independientes. PBMCs se incubaron con fase PFA fijos semilogarítmica tipo salvaje C . células de albicans (NGY152), a un MOI de 0.5 durante 24 h. La secreción de citoquinas se cuantificó por ELISA, c) TNFα, d) IL-6, e) IL-1β, f) IFNγ. Los datos representan la media ± SEM de seis donantes (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001).

Para deducir si adaptación de C . albicans a resultados bajos de pH en una respuesta inmune innata pro-inflamatoria aumentada, la respuesta de citocinas de los monocitos de sangre periférica (PBMCs) expuestos a C . Se examinó albicans adaptados a diferentes condiciones ambientales de pH. C . albicansadaptado para ambientes ácidos provocado una respuesta de citoquinas proinflamatorias mucho más fuerte a partir de PBMCs que C . células albicans cultivadas en condiciones más alcalinas ( Fig. 9C-9F ). Específicamente, C . albicansLas células cultivadas en YPD amortiguadas a pH4 indujeron una mayor secreción de TNFα, IFN-γ, IL-6 e IL-1β en comparación con las células cultivadas en YPD amortiguadas a pH6 o pH8. Por lo tanto, DE-encubrimiento de la pared celular fúngica en respuesta a pH ácido promueve el reconocimiento inmune innato de C . albicans .

Los mutantes rim101 Δ y bcr1 Δ mostraron niveles de exposición a quitina a pH 6 similares a los observados a pH4. Como se ha demostrado que la quitina suprime el sistema inmune innato [  ,  ], probamos si el aumento de quitina en estos mutantes afectaba la respuesta inmune innata. Las tasas de fagocitosis en ambos mutantes se redujeron en comparación con la cepa de control parental ( Fig . S4 ). Sin embargo, esto no tuvo impacto en la respuesta de las citoquinas ( S4 Fig ). Por lo tanto, la estructura alterada de la pared celular en estos mutantes afecta la fagocitosis, pero no es suficiente para afectar las respuestas de citocinas proinflamatorias.

La fagocitosis mejorada está mediada por el reconocimiento de β-glucano por Dectin-1

El β-glucano es reconocido por el receptor de tipo lectina tipo C Dectin-1 [  ]. Como el anticuerpo monoclonal anti-β1,3-glucano específico confirmó que el crecimiento en condiciones ácidas dio como resultado el desenmascaramiento de β-glucano, se evaluó la accesibilidad de este β-glucano expuesto a Dectin-1. La tinción inmunofluorescente de células cultivadas con ácido usando Fc-Dectin-1 confirmó que la Dectina-1 se une más fácilmente a las células cultivadas en condiciones ácidas ( Fig. 10A ). Para determinar si esta unión mejorada de Dectin-1 a la superficie de las células cultivadas con ácido dio como resultado un aumento de la tasa de fagocitosis, se expresó Dectin-1 en la superficie de los fibroblastos. Los fibroblastos que expresan Dectin-1 más unido fácilmente C . células de albicans cultivadas en condiciones ácidas que las células cultivadas con YPD o pH8 (Fig. 10B ). No se observó adhesión mejorada en fibroblastos que no expresaban Dectin-1, y podrían bloquearse usando fosfato de glucano (Fig. 10C ), confirmando que la adhesión mejorada se debe a una interacción específica entre Dectin-1 y β-glucano expuesto a la superficie, y no debido a diferencias en las propiedades electroquímicas de la pared celular.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g010.jpg

El reconocimiento inmunitario mejorado de células adaptadas ácidas está mediado por Dectin-1.

a) Unión de Fc-Dectina-1 al tipo C salvaje . las células de albicans crecidas hasta la fase de registro medio en YPD amortiguadas al pH apropiado, tal como se cuantifica mediante FACS contando 10,000 eventos por repetición. El aumento de pliegue es relativo al YPD sin búfer. b) C . Albicans se cultivó en YPD al pH apropiado para la fase de registro medio, se incubó conjuntamente con fibroblastos durante 1 h, se fijó y se determinó el índice de asociación (número de células fúngicas unidas y fagocitadas / 100 macrófagos). c)Asociación de ácidos C adaptados . células de albicans a fibroblastos que expresan Dectin-1 en presencia de fosfato de glucano. re)Macrófagos J774.1A se pre-incubaron con fosfato glucano y se infectaron con C . albicans con un MOI de 5 y el índice de fagocitosis (número de células fúngicas fagocitadas / 100 macrófagos) determinado después de 1 h. e) los macrófagos J774.1A se pre-incubaron con fosfato glucano y se infectaron con C . albicans con un MOI de 5 y el índice de asociación determinado después de 1 h. Los datos representan la media ± SEM de tres repeticiones independientes (* p> 0.05. *** p> 0.001).

Para confirmar aún más el papel de la Dectina-1, el receptor de Dectina-1 se bloqueó con fosfato de glucano. El bloqueo de Dectin-1 en la línea celular de macrófagos J774.1A, resultó en una disminución dependiente del pH en la fagocitosis ( Figura 10D ), pero no afectó a la asociación de C . albicans con el macrófago, con células adaptadas al ácido que todavía muestran una asociación mejorada ( Fig. 10E ). Por lo tanto, se requiere Dectin-1 para mejorar la fagocitosis, pero otros receptores de reconocimiento de patrones son responsables de la unión inicial de C adaptada al ácido . albicans a la superficie de las células inmunes innatas.

La adaptación al pH ácido da como resultado un mayor reclutamiento de células inmunes in vivo

Evaluación de la respuesta inmune innata a ácido adaptada C . las células de albicans confirmaron que el aumento de la exposición al glucano produce una respuesta inmune proinflamatoria aumentada. Para investigar la in vivo importancia de este descubrimiento, vivir C . Se inyectaron células de Albicansadaptadas a diferentes condiciones de pH en la cavidad peritoneal de ratones, y se determinó el reclutamiento de células inmunes innatas después de 4 horas. C . albicans células adaptadas a entornos ácidos reclutaron más linfocitos CD45 + de C . células de albicans adaptadas a pH6 ( Fig. 11A, P = 0,007), incluyendo significativamente más neutrófilos que C . células de albicans adaptadas a medios de pH6 ( Fig. 11B , p = 0.010). Sin embargo, el análisis de la población celular general confirmó que aunque el número total de células inmunes reclutadas aumentó, no hubo diferencias significativas entre los porcentajes de cada tipo de célula reclutada ( Fig. 11C , p = 0.540). Por lo tanto, C . las células de albicansadaptadas a ambientes ácidos inician una respuesta inmune innata proinflamatoria más fuerte y reclutan significativamente más células inmunes al sitio de la infección.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g011.jpg

C . Las células albicans adaptadas a ambientes ácidos reclutan más células inmunes innatas in vivo .

a) Número total de CD45 +, CD11b + y Ly-6B.2 + (7/4 clon) células (incluyendo monocitos y neutrófilos) reclutados en la cavidad peritoneal después de 4 h de exposición a C . albicans incubados en pH6 o pH4 YPD (p = 0.007). b) Número total de neutrófilos (identificados adicionalmente usando F4 / 80) reclutados en la cavidad peritoneal (p = 0.010) c) Porcentaje de neutrófilos en la población total de células inmunes innatas reclutadas (p = 0.540).

Discusión

C . Albicans tiene una capacidad notable para responder y adaptarse a una multitud de señales ambientales. Aquí, demostramos que la adaptación a los resultados de pH bajo en la remodelación significativa de la C . pared celular de albicans . Los efectos más llamativos incluyen la eliminación de la capa de la quitina subyacente y el β-glucano. El desenmascaramiento de estos epítopos de carbohidratos subyacentes fue un proceso activo, y fue independiente de la pérdida de fosfomanano, lo que sugiere que la escisión química de este componente de la pared celular externa no agotó lo suficiente la armadura externa de manano como para revelar patrones moleculares asociados a patógenos internos (PAMP).

La quitina se remodela en la pared celular a través de las acciones de las quitinasas. C . albicans expresa cuatro quitinasas [  ], sin embargo, solo la eliminación de CHT2 impidió la eliminación de la quitinadependiente del pH. Cht2 se expresa principalmente en células de levadura, y está anclado en GPI a la pared celular [  ]. El desenclavamiento dependiente del pH de la quitina de la pared celular también dependía de los factores de transcripción Rim101 y Bcr1. Rim101 se procesa en C-terminal en respuesta a ambientes alcalinos a través de la cascada de señalización RIM101 , y activa la expresión de genes alcalinos inducidos, mientras reprime la transcripción de genes inducidos por ácido [ ] Bcr1 es esencial para la formación de biopelículas y controla la expresión de muchos genes asociados a la pared celular, incluidos HWP1 , ALS1 , ALS3 e HYR1 [  ]. La expresión de CHT2 dependía de Bcr1, y mostró una expresión dependiente de pH de Rim101 en entornos por encima de pH6. Este aumento alcalino dependiente de la expresión se perdió en el mutante bcr1 Δ, lo que sugiere que Bcr1 es esencial para la expresión de CHT2 , como se indica en los análisis transcriptómicos a gran escala [  ]. Sin embargo, Bcr1 también regula positivamente RIM8 [  ], lo que sugiere que la inactivación de BCR1También disminuiría el procesamiento de Rim101, uniendo las dos vías ( Fig. 12A ).

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es ppat.1006403.g012.jpg

Regulación de la remodelación de la pared celular durante la adaptación al pH ambiental.

a) En entornos por encima de pH 5.5, la ruta Rim101 se activa dando como resultado el procesamiento C-terminal de Rim101 y mejorar la expresión de CHT2 . El complejo She3 luego transporta ARNm de CHT2 a la pared celular, donde se traduce y se une a través de su ancla GPI. A pH 4, Rim101 no está activado, lo que resulta en una expresión reducida de Cht2. b) (i) Cuando está presente en la pared celular (es decir, por encima de pH 5.5), Cht2 hidroliza el polímero de quitina en crecimiento en fragmentos más cortos que pueden unirse por hidrógeno y formar microfibrillas de quitina cortas que están incrustadas profundamente dentro de la pared celular. (ii)Cuando hay cantidades reducidas de Cht2 en la pared celular (es decir, entornos por debajo de pH 4), el polímero de quitina en crecimiento se escinde de manera menos eficiente, lo que resulta en la incorporación de polímeros de quitina más largos que están más expuestos en la superficie exterior de la pared celular.

Una hipótesis para el desenmascaramiento de la quitina es que durante el crecimiento en ambientes neutros o alcalinos, Rim101 y Bcr1 activan la expresión de CHT2 . She3 luego entrega ARNm de CHT2 a la pared celular, donde se traduce y se incorpora a la pared celular a través de su ancla GPI. Se predice que Cht2 posee actividad endo-quitinasa. Por lo tanto, una vez en la pared celular, Cht2 actuaría internamente en las microfibrillas de quitina, disminuyendo su longitud y permitiendo la incorporación correcta en la capa interna de la pared celular. Sin embargo, durante el crecimiento en condiciones ácidas, Rim101 está inactivo, lo que resulta en niveles transcripcionales más bajos de CHT2y otras enzimas reguladoras de la pared celular. En este caso, habrá menos Cht2 para actuar sobre las microfibrillas de quitina, lo que puede aumentar la longitud de estas microfibrillas, dificultando su incrustación en la capa interna de la pared celular y resultando en una mayor exposición de quitina en la superficie celular ( Fig. 12B )

Más sorprendente que el desenmascarado de la quitina fue el desenmascaramiento del PAMP altamente proinflamatorio, el β-glucano. La disección de las vías clave que se sabe que están involucradas en la regulación de la biosíntesis de la pared celular y la detección del pH sugirió que estas vías convencionales no son responsables de regular el cambio en la distribución de β-glucano. En S . cerevisiae , la adaptación a ambientes ácidos tiene efectos opuestos que inducen el enmascaramiento de β-glucano, que está mediado por la vía de transducción de señales Hog1 [  ]. Supresión de HOG1 no tuvo impacto en desenmascaramiento β-glucano en C . albicans , lo que sugiere que se ha producido significativa recableado transcripcional durante la evolución entre S .cerevisiae y C . albicans .

C . albicans se aisló a partir de 95% de los casos de candidiasis vulvovaginal (VVC), con el 5% restante de infecciones está causada principalmente por C . glabrata [  ]. Durante la colonización de la mucosa vaginal C . albicans está expuesto a muchas condiciones ambientales, incluido un pH bajo de la mucosa (pH vaginal = 3.5-4.5). A diferencia de la vaginosis bacteriana, que está asociada con la alcalinización de la mucosa vaginal, durante el VVC, el pH de la mucosa permanece bajo [  ]. Por lo tanto, tanto durante la colonización e infección de la mucosa vaginal, C . albicans está expuesto a condiciones ácidas.

El desenmascaramiento dependiente del pH de la pared celular da como resultado un reclutamiento mejorado de células inmunes innatas in vivo , lo que se correlaciona con una producción mejorada de citocinas proinflamatorias. Nuestros ensayos in vitro confirman que este reconocimiento inmune mejorado fue mediado a través de la lectina de tipo C, como el receptor Dectin-1, un receptor dominante en la inmunidad innata fúngica conocida por reconocer el β-glucano [  ].

Colonización vaginal sintomática por C . los resultados de albicans en la migración excesiva de neutrófilos, con secreciones vaginales que muestran un potencial quimiotáctico mejorado y un mayor daño a la mucosa [  ]. El agotamiento de neutrófilos reduce la inflamación y los síntomas asociados con VVC [  ], lo que sugiere que el reclutamiento de neutrófilos en VVC no es protector, en contraste con la candidiasis oral donde el reclutamiento de neutrófilos y la activación de las respuestas Th17 son protectores [  ].

Crecimiento de C . albicans en VSM (un medio que se parecía más al fluido vaginal) confirmó que el desenmascaramiento de β-glucano no es específico del medio, sino que depende del pH, y el desenmascaramiento solo ocurre a pH ácido. Esto plantea preguntas sobre el vínculo entre el desenmascaramiento de β-glucano y VVC, ya que los modelos de VVC de ratón, que provocan inmunopatologías similares a las muestras humanas, tienen un pH vaginal neutro, no ácido, [  ]. Aunque los modelos de mouse pueden replicar algunas condiciones experimentadas durante VVC, estos todavía no proporcionan un modelo completo de VVC. Por ejemplo, los ratones no son naturalmente colonizadas por C . albicansen el tracto vaginal, y normalmente están inmunodeprimidos con estrógenos para mantener la colonización y es poco probable que el alto inóculo utilizado para establecer la infección refleje cargas fúngicas durante el inicio de la VVC [  ]. Las células utilizadas para la inoculación intravaginal también serán inmunogénicamente diferentes a las adquiridas del tracto GI o la piel, que es la fuente principal de siembra vaginal en VVC humano. Finalmente, el pH neutro de la mucosa vaginal de ratón favorecería el desarrollo de hifas rápida de C . albicans , que activará la vía del inflamasoma más rápidamente, lo que aumentará la activación epitelial y la secreción de citocinas proinflamatorias [ ] Por lo tanto, aunque el modelo de ratón es paralelo a los síntomas de la CVV humana, todavía sabemos si la inmunopatología observada surge del mismo mecanismo subyacente. Por ejemplo, recientemente se ha informado que los neutrófilos también promueven el enmascaramiento de β-glucano [ ], lo que también aumentaría la inflamación. Por lo tanto, aunque tenemos modelos animales para VVC, actualmente no reflejan directamente la infección humana. Es concebible que en el VVC humano, un aumento gradual de la carga fúngica en combinación con el enmascaramiento dependiente del pH del β-glucano inmunoestimulador en las células de levadura y hifas, como respuesta a los cambios ambientales dentro del nicho vaginal, podría iniciar un proceso más temprano. respuesta de citocina proinflamatoria más fuerte, lo que resulta en un mayor reclutamiento de neutrófilos que causa colonización vaginal sintomática.

Referencias

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5456412/

Port Relacionados

Leave a comment

ESCRIBENOS