Calle Castalla, 2, 03440 Ibi, Alicante, Espa帽a

Se debe erradicar el concepto de alcalinizaci贸n=mejor铆a de las micosis

La adaptaci贸n de聽Candida albicans聽al pH ambiental acido induce la remodelaci贸n de la pared celular y mejora el reconocimiento inmune innato

Resumen

Candida albicans聽puede proliferar en entornos que var铆an dr谩sticamente en el pH ambiental, un rasgo requerido para colonizar nichos como el est贸mago, la mucosa vaginal y el tracto gastrointestinal.聽Aqu铆 mostramos que el crecimiento en entornos 谩cidos implica la remodelaci贸n de la pared celular que da como resultado una exposici贸n mejorada a quitina y 尾-glucano en la periferia de la pared celular.聽Desenmascaramiento de la inmuno-estimuladoras 尾-glucano subyacente en ambientes 谩cidos mejorada reconocimiento inmune innato de聽C聽.聽albicanspor macr贸fagos y neutr贸filos, e indujo una respuesta de citocina proinflamatoria m谩s fuerte, impulsada a trav茅s del receptor tipo lectina tipo C, Dectin-1.聽Esta respuesta inflamatoria mejorada result贸 en un reclutamiento significativo de neutr贸filos en un modelo de infecci贸n intraperitoneal, un sello distintivo de la colonizaci贸n vaginal sintom谩tica.聽La exposici贸n a quitina mejorada result贸 de la expresi贸n reducida de la quitinasa Cht2 de la pared celular, a trav茅s de una cascada de se帽alizaci贸n dependiente de Bcr1-Rim101, mientras que la exposici贸n aumentada a 尾-glucano se regul贸 a trav茅s de una v铆a de se帽alizaci贸n no can贸nica.聽Proponemos que este “desenmascaramiento” de la pared celular puede inducir una hiperactivaci贸n no protectora del sistema inmune durante el crecimiento en nichos 谩cidos, y puede atribuirse a una infecci贸n vaginal sintom谩tica.

Resumen del autor

Para poder colonizar un hu茅sped o causar infecci贸n, los microbios deben poder adaptarse y responder a los cambios en su entorno.聽Una de las se帽ales ambientales m谩s importantes para los agentes pat贸genos oportunistas es pH ambiente, con cambios en el pH externo resultantes en fenot铆pica, metab贸licas y cambios f铆sicos en hongos y bacterias (es decir,聽E聽.聽Coli聽,聽Salmonella聽,聽Aspergillus聽,聽Candida聽).聽Candida albicansEs un pat贸geno f煤ngico oportunista de los humanos que puede colonizar e infectar nichos de pH variable, incluida la mucosa 谩cida de la vagina.聽Aqu铆 mostramos que el crecimiento en un ambiente 谩cido da como resultado una modificaci贸n estructural de la pared celular f煤ngica, una clave din谩mica de org谩nulos para el reconocimiento inmune.聽Estas perturbaciones de la pared celular dieron como resultado un reconocimiento inmune mejorado del pat贸geno f煤ngico, una fuerte respuesta inmune proinflamatoria y un reclutamiento mejorado de neutr贸filos.聽Por lo tanto, la colonizaci贸n de la mucosa 谩cida puede desenmascarar los componentes de la pared celular que desencadenan la hiperactivaci贸n de la respuesta inmune innata y podr铆an contribuir a la inmunopatolog铆a asociada con la candidiasis vaginal.

Introducci贸n

El pat贸geno f煤ngico oportunista聽Candida albicans聽es un comensal en hasta el 80% de la poblaci贸n, y puede causar infecciones superficiales de la mucosa en individuos sanos [聽聽,聽聽] y enfermedad invasiva en pacientes inmunodeprimidos [聽聽,聽聽].聽Las infecciones de la mucosa aumentan la morbilidad de la poblaci贸n y son caras de tratar, mientras que la enfermedad diseminada se asocia con altas tasas de mortalidad [聽聽,聽].

Un atributo de聽C聽.聽Albicans聽que lo ha convertido en un pat贸geno oportunista tan exitoso es su capacidad de adaptarse y proliferar en una amplia gama de entornos host.聽Una de las condiciones ambientales m谩s importantes que fluct煤an entre diferentes nichos es el pH ambiental.聽C聽.聽albicans聽es capaz de crecer en medios que van desde pH 2 a pH 10, y聽C聽.聽Albicans聽se ha aislado de una variedad de sitios anat贸micos que var铆an dr谩sticamente en el pH ambiental, incluido el est贸mago (pH2) [聽聽], la vagina (pH4-5) [聽聽] y la mucosa oral (pH6) [聽聽], lo que sugiere que la adaptaci贸n a El pH ambiental es clave para la patogenicidad deC聽.聽albicans聽.聽Adaptaci贸n de聽C聽.聽albicans聽a ambientes 谩cidos regula procesos biol贸gicos clave, incluida la morfog茅nesis [聽聽], el cambio de blanco a opaco y el apareamiento [聽聽].聽Sin embargo, el impacto que tiene la adaptaci贸n ambiental en la estructura y composici贸n de la pared celular f煤ngica, el primer punto de contacto entre el hongo y el hu茅sped, no est谩 bien definido.

La pared celular f煤ngica es una estructura compleja de varias capas de manoprote铆nas, 尾-glucanos y quitina que proporciona rigidez y forma y protege al hongo del medio ambiente [聽聽].聽Estos motivos de prote铆nas y carbohidratos son inmunog茅nicos y juegan papeles importantes en el reconocimiento inmune innato [聽].聽La adaptaci贸n ambiental influye en el proteoma de la pared celular e impacta en la estructura de los glicanos que decoran las prote铆nas de la pared celular [聽聽].聽Por ejemplo, el crecimiento en los medios sangu铆neos o de lactato disminuye la complejidad estructural de las fibrillas de manano externas [聽聽–聽聽], mientras que el tratamiento con medicamentos antimic贸ticos influye en la exposici贸n al 尾-glucano [聽聽,聽]聽Los cambios estructurales en la pared celular, como resultado de la mutaci贸n en enzimas clave del ensamblaje de la pared celular glucol铆tica, confirman que la modulaci贸n de la pared celular tiene profundas implicaciones para el reconocimiento inmune innato [聽聽].聽Por lo tanto, entender c贸mo la adaptaci贸n ambiental impacta en la biog茅nesis de la pared celular y la consecuencia que esta remodelaci贸n de la pared celular tiene en el reconocimiento inmune innato es un 谩rea importante, pero poco estudiada, de la biolog铆a f煤ngica.聽Aqu铆, investigamos c贸mo la adaptaci贸n a ambientes 谩cidos que imitan el pH de la mucosa vaginal impacto sobre la estructura y composici贸n de la聽C聽.聽albicans聽pared celular y deducir c贸mo esta remodelaci贸n de la pared celular afecta el reconocimiento inmune innato del pat贸geno.

Resultados

El crecimiento en ambientes 谩cidos altera la ultraestructura de la pared celular f煤ngica

El impacto de la adaptaci贸n al pH ambiental en la ultraestructura de la pared celular se investig贸 mediante microscop铆a electr贸nica de transmisi贸n.聽Se tomaron im谩genes de la pared celular de las c茅lulas de levadura de fase media logar铆tmica cultivadas en YPD tamponado a pH2, pH4, pH6, pH8 y YPD est谩ndar.聽Bajo todas las condiciones probadas, la pared celular mantuvo dos capas distintas: una capa interna compuesta de glucano y quitina, y una capa externa fibrilar de manoprote铆nas.聽Sin embargo, la adaptaci贸n a las condiciones 谩cidas result贸 en una p茅rdida significativa de organizaci贸n estructural en la pared celular externa, que parec铆a ser menos fibrilar (聽Fig. 1A)聽La cuantificaci贸n del grosor de la capa de la pared celular exterior confirm贸 que la adaptaci贸n a ambientes 谩cidos redujo significativamente la longitud de la fibrilla de manano (pH2 23.23 卤 3.58 nm (p = 0.0001), pH4 39.49 卤 4.61 nm (p = 0.0495), en comparaci贸n con pH6 60.22 卤 10.73 nm;聽Fig. 1B聽).聽Presumimos que esta p茅rdida de estructura fibrilar podr铆a deberse a cambios en la arquitectura subyacente de la pared celular.聽Por lo tanto, investigamos si el pH influye de manera similar en la estructura de la quitina.

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La adaptaci贸n al pH ambiental altera la ultraestructura de la pared celular f煤ngica.

a)聽Micrograf铆as electr贸nicas que muestran la ultraestructura de las paredes celulares de tipo聽C聽salvaje聽.聽albicans聽(NGY152) crecido hasta la fase de registro medio en YPD tamponado al pH apropiado.聽La barra de escala representa 100 nm.聽b)聽Cuantificaci贸n del grosor de la capa interna de la pared celular y la longitud de fibrilla de la manoprote铆na.聽Los datos representan la media 卤 SEM de 5 c茅lulas individuales.聽Cada c茅lula se midi贸 en 30 puntos diferentes alrededor de la periferia celular (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).

Los ambientes 谩cidos inducen la reorganizaci贸n de la pared celular f煤ngica a trav茅s de la modulaci贸n de la quitina.

Aunque quitina s贸lo forma una peque帽a fracci贸n de la pared celular f煤ngica (3-5% en peso seco), un mecanismo de compensaci贸n importante de聽C聽.聽Albicans聽al estr茅s de la pared celular es regular la s铆ntesis de quitina para aumentar la integridad de la pared celular [聽聽].聽Para identificar si la desorganizaci贸n observada en la capa de la pared celular externa fue el resultado de una mayor incorporaci贸n de quitina, la pared celular de las c茅lulas adaptadas 谩cidas se ti帽贸 con Calcofluor White (CFW).聽La cuantificaci贸n de la fluorescencia CFW indic贸 que el contenido de quitina de la pared celular solo se elev贸 a pH 2 (聽Fig. 2A聽), un resultado que fue confirmado por HPLC (聽Tabla 1), lo que sugiere que la adaptaci贸n a entornos de pH muy bajo requiere la s铆ntesis de quitina.聽Sin embargo, la tinci贸n de la pared celular con aglutinina de germen de trigo (WGA), una lectina que une la quitina expuesta a la superficie, indic贸 que incluso la adaptaci贸n al pH 4 requiri贸 la reorganizaci贸n de la quitina de la pared celular, con quitina cada vez m谩s expuesta durante la adaptaci贸n al pH 谩cido (聽Fig. 2B聽).聽La microscop铆a confirm贸 que las c茅lulas adaptadas al pH 谩cido mostraron un importante desenmascaramiento de quitina alrededor de la periferia celular, con una intensa tinci贸n de WGA en las cicatrices de las yemas a pH 2 (聽Fig. 2C聽).聽Para deducir si este fen贸meno de desconexi贸n es un proceso activo, analizamos la eliminaci贸n de la quitina en respuesta al pH en las c茅lulas muertas.聽El desacoplamiento de la quitina de la pared celular solo se produjo en c茅lulas vivas (聽S1 Fig.), confirmando que el aumento observado en la exposici贸n superficial de quitina no fue un efecto f铆sico del pH simplemente degradando la pared celular.聽Por lo tanto, la adaptaci贸n a entornos 谩cidos es un proceso de dos etapas con entornos 谩cidos moderados (pH 4) que provocan el desenmascaramiento activo de la quitina y entornos 谩cidos fuertes (pH2) que inducen la聽s铆ntesis de novo de聽quitina y un mayor desenclavamiento de la qu

La adaptaci贸n a ambientes 谩cidos promueve la exposici贸n superficial de quitina.

a)聽Se hicieron crecer c茅lulas de tipo salvaje (NYG152) en YPD tamponado al pH apropiado, se ti帽eron con CFW y se cuantific贸 la fluorescencia por FACS.聽El aumento de veces en la tinci贸n de CFW se determin贸 a partir de los valores de MFI sustra铆dos de fondo del an谩lisis FACS, y se normaliz贸 a c茅lulas crecidas con YPD.聽b)聽Aumento del doblez en la fluorescencia de FITC de c茅lulas de tipo salvaje te帽idas con FITC-WGA (NYG152) crecidas a pH diferente, en relaci贸n con el crecimiento en YPD tal como se cuantific贸 mediante an谩lisis FACS.聽Todos los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.聽c)Microscop铆a de c茅lulas te帽idas con WGA.聽Las puntas de flecha indican exposici贸n a quitina.聽Barra de escala = 10 渭m.

tabla 1

Proporciones relativas en peso seco (%) de glucano y quitina en la pared celular cuantificadas por HPLC.
Condici贸n Quitina Glucano
pH2 21,11 (卤 3,71) 78,89 (卤 3,71)
pH4 10,69 (卤 9,77) 89,31 (卤 9,77)
pH6 7,97 (卤 0,83) 87,26 (卤 7,58)
pH8 7,73 (卤 5,42) 88,02 (卤 0,51)

Ni Mkc1, Hog1 ni Crz1 regulan la exposici贸n a la quitina en respuesta al estr茅s de pH moderado

La s铆ntesis de quitina est谩 regulada por la recuperaci贸n de la pared celular, las v铆as de se帽alizaci贸n de calcio / calcineurina y glicerol de alta osmolaridad (HOG) [聽聽].聽Para evaluar si estas v铆as est谩n involucradas en la reorganizaci贸n de la quitina, se determin贸 la activaci贸n de estas cascadas de se帽alizaci贸n en respuesta al pH ambiental.聽Hog1 no se activ贸 durante el crecimiento exponencial en entornos de pH diferente (聽Fig. 3A聽).聽De acuerdo con esto, la eliminaci贸n de聽HOG1聽no tuvo impacto en la exposici贸n superficial de quitina durante la adaptaci贸n a entornos de pH 4 (聽Fig. 3B聽).聽Aunque la v铆a de recuperaci贸n de la pared celular se activ贸 en respuesta a ambientes 谩cidos (聽Fig. 3C聽), la eliminaci贸n de聽MKC1聽y聽RLM1no impidi贸 la remodelaci贸n de la pared celular que da como resultado el desenmascaramiento de la quitina subyacente (聽Fig. 3B y 3D聽).聽La eliminaci贸n de聽CRZ1聽, el factor de transcripci贸n aguas abajo de la v铆a del calcio / calcineurina, tampoco tuvo impacto en la exposici贸n a la quitina en el 谩cido聽C聽adaptado聽.聽c茅lulas聽albicans聽(聽Fig. 3D聽).聽Por lo tanto, estas v铆as no est谩n involucradas en la reorganizaci贸n de la quitina durante la adaptaci贸n a ambientes de pH 4.

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Mkc1, Hog1 y Crz1 no son necesarios para la eliminaci贸n de la capa de quitina en respuesta al pH 谩cido.

a)聽A聽C聽.聽La聽cepa de聽albicans que聽expresaba Hog1-GFP se cultiv贸 en YPD tamponado al pH apropiado durante 4 hy la localizaci贸n (citoplasm谩tica frente a nuclear) de Hog1 se puntu贸 en 200 c茅lulas por condici贸n.聽Como control positivo de la activaci贸n de Hog1, las c茅lulas cultivadas en YPD se incubaron con NaCl 1 M durante 30 minutos antes de la obtenci贸n de im谩genes.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.聽b)聽Aumento de la tinci贸n de WGA y CFW en mutantes de quinasa cultivados a pH 4 en relaci贸n con YPD seg煤n cuantificado por an谩lisis FACS.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.聽DAY286 es la cepa control de los padres de los dos quinasa mutantes聽c)聽de tipo salvaje聽C聽.聽albicans(NGY152) se hizo crecer hasta la mitad de la fase logar铆tmica en YPD tamponado al pH apropiado, se extrajo la prote铆na total y se evalu贸 la activaci贸n de Mkc1 y Cek1 mediante transferencia Western usando el anticuerpo MAPK p42 / p44 que reacciona de forma cruzada con ambas quinasas.聽La flecha indica Mkc1, mientras que la punta de flecha indica Cek1.聽d)聽Aumento de la tinci贸n de WGA y CFW en mutantes del factor de transcripci贸n a pH 4 en relaci贸n con YPD seg煤n se cuantific贸 mediante an谩lisis FACS.聽SN152 es la cepa de control parental de los dos mutantes del factor de transcripci贸n.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.

Rim101 y Bcr1 coordinan la localizaci贸n correcta de quitina en la pared celular mediante la regulaci贸n de Cht2

La quitina se puede remodelar en la pared celular a trav茅s de las acciones de cuatro quitinasas (Cht1-4) [聽].聽Por lo tanto, se determin贸 el papel de estas enzimas quitinasas en el desacoplamiento de quitina en respuesta al pH ambiental.聽La eliminaci贸n de聽CHT2聽dio聽como聽resultado una mayor exposici贸n a la quitina a pH 6 (聽Fig. 4A聽) en comparaci贸n con las cepas de control parental.聽Para determinar si la expresi贸n de聽CHT2聽est谩 regulada por el pH ambiental, se realiz贸 una RT-PCR semicuantitativa.聽La聽expresi贸n de聽CHT2se reprimi贸 en entornos 谩cidos en comparaci贸n con entornos de pH 6 o pH 8 (聽Fig. 4B聽).聽El perfil transcripcional a gran escala sugiere que la expresi贸n de聽CHT2聽depende en gran medida del factor de transcripci贸n Bcr1 [聽].聽Para confirmar esto, se determin贸 la expresi贸n de聽CHT2聽en una聽cepa mutante聽bcr1.聽La聽expresi贸n de聽CHT2聽se redujo significativamente en el聽mutante聽bcr1聽en todas las condiciones de pH analizadas (聽Fig. 4C聽), confirmando un papel dominante para Bcr1 en la expresi贸n de聽CHT2聽.

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El enmascaramiento de quitina en la pared celular est谩 regulado por Rim101 y Bcr1 y requiere Cht2.

a)聽Se cultivaron las cepas respectivas en YPD tamponado a pH 4 o pH 6 a la mitad de la fase logar铆tmica, se fijaron las c茅lulas, se ti帽eron con FITC-WGA y se cuantific贸 la fluorescencia mediante FACS.聽b) Se聽hizo crecer SC5314 hasta la mitad de la fase logar铆tmica en YPD tamponado a pH 4, pH 6 y pH 8, se congel贸 r谩pidamente y se extrajo el ARN total.聽La expresi贸n de聽CHT2聽se determin贸 por RT-PCR semicuantitativa utilizando 50 ng de ARN total.聽Los niveles de expresi贸n se normalizaron a聽ACT1聽.聽c)聽Expresi贸n relativa de聽CHT2聽en聽rim101聽螖 y聽bcr1聽螖 mutantes crecimiento exponencialmente en YPD tamponado a pH4, pH6 y pH8 y determinado por RT-PCR semicuantitativa.聽Los niveles de expresi贸n se normalizaron a聽ACT1聽.聽re)An谩lisis FACS de tinci贸n WGA en聽mutantes rim101聽螖 y聽bcr1聽螖.聽e)聽An谩lisis FACS de la tinci贸n WGA en CARP1-1 que expresa Rim101 constitutivamente activo.聽f)聽An谩lisis FACS de la tinci贸n WGA en聽mutantes聽she3聽螖.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.聽(**** p <0.0001, *** p <0.001, ** p <0.01, * p <0.05).

Para investigar el mecanismo por el cual聽CHT2聽se reprime durante la adaptaci贸n a entornos 谩cidos, nos centramos en el factor de transcripci贸n Rim101.聽Rim101 ha demostrado previamente que regula la expresi贸n de las enzimas modificadoras de la pared celular Phr1 y Phr2 en respuesta al pH ambiental [聽聽], se ha implicado en la reorganizaci贸n de la pared celular [聽聽] y es un activador de la expresi贸n g茅nica en entornos alcalinos [聽聽]聽La expresi贸n de聽CHT2聽se reprimi贸 en el聽mutante聽rim101聽螖 en entornos por encima de pH6 (聽Fig. 4C聽), con聽niveles de expresi贸n de聽CHT2聽a pH6 o pH8 comparables a pH4, lo que sugiere que Rim101 es un activador dependiente del pH deExpresi贸n聽CHT2聽.聽La expresi贸n alcalina inducida de聽CHT2depend铆a de Bcr1, ya que los聽niveles de聽CHT2聽permanecen bajos en todas las condiciones de pH en el聽mutante聽bcr1聽螖 (聽Fig. 4C聽).

Para determinar c贸mo la desregulaci贸n de la聽expresi贸n聽de聽CHT2聽afecta la exposici贸n a la quitina, los聽mutantes bcr1聽螖 y聽rim101聽螖 se cultivaron en YPD tamponado a pH4 y pH6, y se ti帽eron con WGA.聽La eliminaci贸n de聽BCR1聽result贸 en una mayor exposici贸n a la quitina a pH 6 (p = 0.0076) y pH4 (p = 0.0491), pero mantuvo cierta dependencia del pH, mientras que la eliminaci贸n de聽RIM101聽result贸 en una exposici贸n constitutivamente alta a la quitina (聽Fig. 4D聽).聽Para investigar si la expresi贸n de Rim101 a pH 4 afectar铆a el fenotipo, cuantificamos la exposici贸n a quitina en una cepa que expresa Rim101 constitutivamente activo (CARP1-1).聽El an谩lisis FACS confirm贸 que la expresi贸n de Rim101 activo en ambientes 谩cidos redujo la exposici贸n a quitina (聽Fig. 4E), pero a煤n era insuficiente para enmascarar completamente la quitina.聽Estos resultados confirman que Rim101 juega un papel importante en la regulaci贸n de los genes de la pared celular fundamentales para corregir la incorporaci贸n de quitina.

El ARNm de聽CHT2聽es un objetivo de She3, que transporta ARNm a la pared celular [聽聽].聽Por lo tanto, determinamos si este complejo tambi茅n es necesario para la correcta incorporaci贸n de quitina en la pared celular.聽La eliminaci贸n de聽SHE3聽dio聽como聽resultado un mejor聽desenmascaramiento聽de quitina en entornos por encima de pH4 (聽Fig. 4F聽), similar a los聽mutantes cht2聽螖 y聽bcr1聽螖.聽Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la incorporaci贸n de quitina en la pared celular interna a pH 6 est谩 regulada por Rim101 y Bcr1 y requiere el suministro de Cht2 dependiente de She3 a la pared celular, mientras que el crecimiento en un ambiente 谩cido inactiva esta v铆a que conduce a una reducci贸n de聽CHT2聽expresi贸n y mayor exposici贸n de quitina en la superficie celular.

El pH bajo promueve el desenmascaramiento del 尾-glucano subyacente

El 尾-glucano es un componente principal de la pared celular, que es altamente inmunoestimulante y, en consecuencia, normalmente est谩 enmascarado por una capa densa de prote铆nas glicosiladas.聽Como resultado, las c茅lulas f煤ngicas tienen un grado de resistencia a las glucanasas extracelulares, que rompen la pared celular y causan lisis celular.聽Por lo tanto, la sensibilidad de聽C聽.聽albicans聽a 尾-glucanase recombinante se puede utilizar como una medida indirecta de la exposici贸n a 尾-glucan [聽聽].聽Crecimiento de聽C聽.聽albicansen ambientes 谩cidos mejora la sensibilidad a la 尾-glucanasa (聽Fig. 5Ai y ii) en comparaci贸n con las c茅lulas cultivadas con pH 6 o pH 8, lo que sugiere que el 尾-glucano es m谩s accesible en c茅lulas cultivadas en medios tamponados a pH 4.聽De acuerdo con esto, la tinci贸n inmunofluorescente de la pared celular con un anticuerpo monoclonal 尾1,3-glucano revel贸 una tinci贸n mejorada alrededor de la periferia de la pared celular (聽Fig. 5B聽).聽La cuantificaci贸n de la tinci贸n inmunofluorescente por FACS revel贸 que las c茅lulas adaptadas al 谩cido ten铆an casi 4 veces m谩s 尾-glucano expuesto a la superficie (聽Fig. 5C) que las c茅lulas cultivadas en medios YPD, lo que sugiere que la adaptaci贸n a entornos 谩cidos induce el desenmascaramiento de 尾-glucano.聽Para descartar la posibilidad de que el pH simplemente degrade la pared celular, exponiendo el 尾-glucano subyacente, las c茅lulas muertas se expusieron a YPD a pH 2, 4 y 6 durante 4 hy la exposici贸n en la superficie se cuantific贸 por FACS.聽Solo las c茅lulas vivas desenmascararon su 尾-glucano en respuesta al pH 谩cido (聽Fig. S1聽), lo que confirma que, al igual que la exposici贸n a la quitina, el desenmascaramiento de 尾-glucano es un proceso activo.

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Ambientes 谩cidos desenmascaran 尾-glucano en聽C聽.聽albicans聽.

ai)聽de tipo salvaje聽C聽.聽Albicans聽(NGY152) se hizo crecer hasta la mitad de la fase logar铆tmica en YPD tamponado al pH apropiado, y se incub贸 con 尾1,3-glucanasa recombinante.聽La disminuci贸n de OD聽600representa la lisis celular cuando la 尾1,3-glucanasa digiere la pared celular y se expresa como un porcentaje de la OD聽600聽inicial聽.聽ii)聽La tasa inicial de lisis celular calculada a partir de los primeros 100 min.聽Los datos representan la media 卤 SEM de cuatro repeticiones independientes聽b)聽Im谩genes inmunofluorescentes de la exposici贸n a 尾-glucano de c茅lulas NGY152 en crecimiento exponencial utilizando un anticuerpo monoclonal anti-尾1,3-glucano.聽Barra de escala = 10 渭m.聽do)Cuantificaci贸n de la exposici贸n a 尾-glucano por FACS contando 10,000 eventos por repetici贸n.聽El aumento de pliegue es relativo al YPD sin b煤fer.聽Los datos representan la media 卤 SEM de seis experimentos independientes.聽d)聽Cuantificaci贸n de la tinci贸n con azul de anilina de c茅lulas NGY152 que crecen exponencialmente mediante an谩lisis FACS contando 10.000 eventos por repetici贸n.聽El aumento de pliegue es relativo al YPD sin b煤fer.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes.聽e)聽la exposici贸n 尾-glucano de cl铆nica聽C聽.聽los聽aislados de聽albicans聽crecidos hasta la mitad de la fase logar铆tmica en YPD tamponados a pH 4 en relaci贸n con YPD.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres experimentos independientes (* p <0.05).

Para determinar si se requer铆a la s铆ntesis de 尾-glucano para este efecto de desenmascaramiento, se cuantificaron los niveles totales de glucano ti帽endo las c茅lulas con azul de anilina.聽La uni贸n del azul de anilina a la pared celular f煤ngica fue consistente en todas las condiciones de pH, lo que sugiere que los niveles totales de 尾-glucano se mantuvieron constantes (聽Fig. 5D聽).聽Adem谩s, el an谩lisis por HPLC confirm贸 que la cantidad de glucosa en la pared celular no era significativamente diferente en las c茅lulas cultivadas en medios tamponados a diferentes pH (聽Tabla 1聽).聽Por lo tanto, el aumento en la exposici贸n a 尾-glucano ocurre como resultado de la remodelaci贸n de la pared celular y no a la s铆ntesis mejorada de 尾-glucano.

Para deducir si des-encubrimiento de la pared celular fue una respuesta de adaptaci贸n general de聽C聽.聽albicans聽, se examin贸 la reorganizaci贸n de la pared celular dependiente del pH de una serie de aislados cl铆nicos de diferentes sitios y tipos de infecci贸n.聽Todos los aislamientos cl铆nicos desacubrieron su pared celular en respuesta a ambientes 谩cidos (聽Fig. 5E聽), lo que confirma que este fen贸meno no se limita a las cepas evolucionadas en laboratorio.

Para investigar si la forma de 谩cido utilizada para pH de los medios afecta al desenmascaramiento, se tampon贸 el medio YPD usando 谩cido l谩ctico, un 谩cido org谩nico producido por Lactobacilli durante la colonizaci贸n de la mucosa vaginal.聽El crecimiento en YPD amortiguado a pH 4 con 谩cido l谩ctico todav铆a indujo el desenmascaramiento de la pared celular, similar a la reducci贸n del pH con HCl (聽Fig. 6A聽).聽Por lo tanto, los 谩cidos fisiol贸gicamente relevantes impulsan el desenmascaramiento de la pared celular de una manera dependiente del pH.聽Con el fin de determinar si los entornos que imitan m谩s estrechamente el entorno del tracto reproductivo femenino inducen remodelaci贸n de la pared celular,聽C聽.聽albicans聽se cultiv贸 en medios de simulaci贸n vaginal (VSM) tamponados a pH 4, pH 6 o pH 7.聽C聽.聽albicansdesenmascararon significativamente m谩s 尾-glucano (p = 0.0022) cuando el VSM fue amortiguado a pH4 que pH6 o pH7 (聽Fig. 6B聽), lo que sugiere que el ambiente dentro del tracto reproductivo femenino tiene el potencial de inducir la exposici贸n de 尾-glucano.聽Debido a que se conocen los sitios de infecci贸n a contener una mezcla de levadura y c茅lulas de hifas,聽C聽.聽Las聽hifas de聽albicans聽se generaron en medios 谩cidos en concentraciones elevadas de di贸xido de carbono, un potente inductor de morfog茅nesis [聽聽] y en presencia de c茅lulas epiteliales vaginales.聽Tanto las c茅lulas de levadura como las hifas mostraron una mayor exposici贸n a quitina y 尾-glucano en comparaci贸n con sus respectivos controles (聽Fig. 6C y 6D)聽Por lo tanto, tanto las c茅lulas de levadura como las hifas se someten a la remodelaci贸n de la pared celular durante la adaptaci贸n a ambientes 谩cidos, lo que resulta en la exposici贸n superficial de 尾-glucano.

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La remodelaci贸n de la pared celular dependiente del pH ocurre en respuesta a 谩cidos fisiol贸gicamente relevantes y no se limita a las c茅lulas de levadura.

a)聽C聽.聽Se cultivaron c茅lulas聽albicans聽(NGY152) en YPD, o YPD tamponado a pH 4 mediante la adici贸n de HCl o 谩cido l谩ctico a la fase de registro medio, fijado con 4% de PFA, te帽ido para exposici贸n a 尾-glucano y quitina y intensidad de fluorescencia cuantificada por FACS.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres repeticiones independientes (**** p <0,0001).聽b)聽C聽.聽Se cultivaron c茅lulas de聽albicans聽(NGY152) en medio de secreci贸n vaginal (VSM) tamponado a pH 4, pH 6 o pH 7 durante 4 h, fijado, te帽ido para 尾-glucano e intensidad de fluorescencia cuantificada por FACS.聽Los datos representan la media 卤 SEM de seis repeticiones independientes (**** p <0.01).聽c)聽C聽.聽albicansLas c茅lulas (NGY152) se cultivaron en placas de 24 pocillos en YPD tamponado a pH 4 y pH 6, DMEM tamponado a pH 4 y pH 6 a 37 掳 C, 150 rpm, o crecieron en DMEM tamponado a pH 4 o pH 6 con 5% de CO聽2聽en presencia o ausencia de c茅lulas epiteliales vaginales A431 durante 4 h.聽Las c茅lulas se fijaron en PFA al 4% y se ti帽eron para聽exposici贸n聽a 尾-glucano聽yd)聽quitina.聽Los resultados son un aumento de veces con respecto al pH 6.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres repeticiones independientes.

Como la adaptaci贸n al pH 谩cido dio como resultado una exposici贸n superficial de la quitina y el glucano, investigamos si estos carbohidratos quedaron expuestos en el mismo punto o en diferentes puntos de la pared celular.聽Las im谩genes inmunofluorescentes dobles con TRITC-WGA y FITC-glucano confirmaron que, si bien la exposici贸n a la quitina se produjo principalmente en cicatrices de brotes a pH 4 con un aumento de la exposici贸n en la pared celular lateral a pH 2, la exposici贸n a glucanos se localiz贸 continuamente para puntear parches alrededor de la periferia celular (聽Fig. 7聽)聽Como los carbohidratos expuestos no se ubicaron conjuntamente, planteamos la hip贸tesis de que no son dependientes entre s铆 y pueden regularse mediante diferentes procesos.

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La exposici贸n de 尾-glucano y quitina no se localiza conjuntamente.

Se cultivaron c茅lulas de聽Candida albicans de聽tipo salvaje聽(NGY152) hasta la mitad de la fase logar铆tmica en YPD tamponado a pH2, pH4 y pH6, se lavaron, se fijaron con PFA al 4% y se ti帽eron con CFW, WGA marcado con TRITC y Fc-Dectin-1 (FITC )聽Las puntas de flecha blancas indican parches de exposici贸n a 尾-glucano.聽La barra de escala representa 10 渭m.

Una hip贸tesis potencial para explicar la respuesta de desenmascaramiento al pH 谩cido es que la escisi贸n qu铆mica del fosfomanano externo podr铆a reducir la complejidad del manano y dar como resultado un escudo de manano externo m谩s poroso, permitiendo el acceso a las capas subyacentes de la pared celular.聽Para probar esta hip贸tesis聽, se examin贸 la聽exposici贸n a carbohidratos despu茅s de la adaptaci贸n al pH 谩cido en el聽mutante聽mnn4聽螖, que carece de fosfomanano [聽聽].聽El聽mutante聽mnn4聽螖聽deshizo聽su pared celular de manera similar a la cepa de control parental (聽S2 Fig聽), lo que sugiere que este fen贸meno no es el resultado de la p茅rdida del fosfomanano y probablemente implica una reorganizaci贸n activa activa de la pared celular.

Candida tropicalis聽tambi茅n desenmascara el 尾-glucano en respuesta al pH 谩cido

Para determinar si desenmascaramiento de 尾-glucano es espec铆fico de聽C聽.聽albicans聽,聽se evalu贸聽el impacto de los ambientes 谩cidos en聽especies de聽Candida聽no聽albicans聽y en聽Saccharomyces cerevisiae聽.聽En marcado contraste con聽C聽.聽albicans聽, el crecimiento en condiciones 谩cidas reduce la sensibilidad de聽S聽.聽cerevisiae聽a? 1,3-glucanasa, lo que sugiere que en respuesta a ambientes 谩cidos聽S聽.聽cerevisiae聽enmascara su 尾-glucano (聽Fig. 8聽), que se ha informado previamente [聽聽].聽Asimismo,聽parapsilosis por Candidatambi茅n mostr贸 una leve, estad铆sticamente insignificante, disminuy贸 sensiblemente a la 尾1,3-glucanasa cuando se cultiv贸 en condiciones 谩cidas (聽Fig. 8聽).聽Por otro lado,聽Candida glabrata聽y聽Candida dubliniensis聽no mostraron ninguna modulaci贸n dependiente del pH de la exposici贸n a 尾-glucano (聽Fig. 8聽).聽Inesperadamente,聽Candida krusei聽desenmascar贸 su 尾-glucano en respuesta a ambientes alcalinos (聽Fig. 8聽), mientras que聽Candida tropicalis聽desenmascar贸 su 尾-glucano en respuesta a pH bajo (聽Fig. 8聽).聽Por lo tanto, de los aislados examinados solamente聽C聽.聽albicans聽y聽C聽.聽tropicalis聽desenmascarar 尾-glucano en respuesta a pH bajo.

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Desenmascaramiento de 尾-glucano en respuesta a pH ambiental es espec铆fico de聽C聽.聽albicans聽y聽C. tropicalis聽.

a)聽Las c茅lulas que crecen exponencialmente en YPD, YPD tamponado a pH 4 y YPD tamponado a pH 8 se incubaron con 尾1,3-glucanasa recombinante.聽La disminuci贸n de OD聽600聽representa la lisis celular cuando la 尾1,3-glucanasa digiere la pared celular y se expresa como un% del OD聽600聽inicial聽.聽Los datos representan la media 卤 SEM de cuatro experimentos independientes.聽b)聽La tasa inicial de lisis celular se calcul贸 a partir de los primeros 100 minutos despu茅s de la adici贸n de 尾-glucanasa.聽Los datos representan la media 卤 SEM de cuatro repeticiones independientes (* p <0.05, ** p <0.01).

Desenmascarar 尾-glucano implica una v铆a de remodelaci贸n de la pared celular no can贸nica

La investigaci贸n de las principales v铆as de transducci贸n de se帽ales que se sabe que est谩n involucradas en la remodelaci贸n de la pared celular (es decir, Mkc1, Hog1, Crz1) confirm贸 que estas v铆as no son necesarias para el desenmascaramiento de 尾-glucano dependiente del pH (聽Fig聽.聽S3聽).聽Debido a la participaci贸n de Rim101 y Bcr1 en la eliminaci贸n de la capa de quitina, planteamos la hip贸tesis de que estos factores de transcripci贸n tambi茅n pueden estar involucrados en el desenmascarado de 尾-glucano.聽Sin embargo, los聽mutantes rim101聽螖 y聽bcr1聽螖 todav铆a desenmascaran 尾-glucano de una manera dependiente del pH (聽S3 Fig).聽Como Rim101 no se somete a procesamiento C-terminal a pH 谩cido, tambi茅n se evalu贸 el desenmascaramiento de 尾-glucano en una cepa que expresa constitutivamente Rim101 activo (CARP1-1).聽La cepa CARP1-1 todav铆a mostraba un desenmascaramiento de 尾-glucano dependiente del pH (聽Fig. S3), lo que sugiere que la cascada de se帽alizaci贸n Rim101 no es necesaria para el enmascaramiento de 尾-glucano dependiente del pH.聽Por lo tanto, mientras Rim101 / Bcr1 regula la exposici贸n a la quitina, una v铆a de se帽alizaci贸n no can贸nica regula el desenmascarado de 尾-glucano dependiente del pH.

Acid adaptado聽C聽.聽las聽c茅lulas de聽albicans聽se fagocitan f谩cilmente e inducen una fuerte respuesta inmune innata

La pared celular es el primer punto de contacto entre el hongo y el sistema inmune del hu茅sped y, por lo tanto, la pared celular juega un papel importante en el reconocimiento inmune innato de los hongos.聽Por lo tanto, se investig贸 el papel de la eliminaci贸n de la pared celular dependiente del pH en la regulaci贸n de las respuestas inmunes innatas.聽C聽.聽albicans聽c茅lulas cultivadas en medios 谩cidos fueron fagocitadas m谩s f谩cilmente por macr贸fagos y neutr贸filos que聽C聽.聽c茅lulas de聽albicans聽cultivadas en medio YPD est谩ndar (聽Fig. 9A y 9B聽).

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La adaptaci贸n a ambientes 谩cidos aumenta el reconocimiento inmune.

C聽.聽albicans聽se cultiv贸 en YPD al pH apropiado para la fase de registro medio, se incub贸 conjuntamente con聽a)macr贸fagos J774.1A聽b)聽neutr贸filos a una MOI = 5 durante 1 hy se determin贸 la tasa de fagocitosis.聽Los datos representan la media 卤 SEM de cuatro repeticiones independientes.聽PBMCs se incubaron con fase PFA fijos semilogar铆tmica tipo salvaje聽C聽.聽c茅lulas de聽albicans聽(NGY152), a un MOI de 0.5 durante 24 h.聽La secreci贸n de citoquinas se cuantific贸 por ELISA,聽c)聽TNF伪,聽d)聽IL-6,聽e)聽IL-1尾,聽f)聽IFN纬.聽Los datos representan la media 卤 SEM de seis donantes (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001).

Para deducir si adaptaci贸n de聽C聽.聽albicans聽a resultados bajos de pH en una respuesta inmune innata pro-inflamatoria aumentada, la respuesta de citocinas de los monocitos de sangre perif茅rica (PBMCs) expuestos a聽C聽.聽Se examin贸聽albicans聽adaptados a diferentes condiciones ambientales de pH.聽C聽.聽albicansadaptado para ambientes 谩cidos provocado una respuesta de citoquinas proinflamatorias mucho m谩s fuerte a partir de PBMCs que聽C聽.聽c茅lulas聽albicans聽cultivadas en condiciones m谩s alcalinas (聽Fig. 9C-9F聽).聽Espec铆ficamente,聽C聽.聽albicansLas c茅lulas cultivadas en YPD amortiguadas a pH4 indujeron una mayor secreci贸n de TNF伪, IFN-纬, IL-6 e IL-1尾 en comparaci贸n con las c茅lulas cultivadas en YPD amortiguadas a pH6 o pH8.聽Por lo tanto, DE-encubrimiento de la pared celular f煤ngica en respuesta a pH 谩cido promueve el reconocimiento inmune innato de聽C聽.聽albicans聽.

Los聽mutantes rim101聽螖 y聽bcr1聽螖 mostraron niveles de exposici贸n a quitina a pH 6 similares a los observados a pH4.聽Como se ha demostrado que la quitina suprime el sistema inmune innato [聽聽,聽聽], probamos si el aumento de quitina en estos mutantes afectaba la respuesta inmune innata.聽Las tasas de fagocitosis en ambos mutantes se redujeron en comparaci贸n con la cepa de control parental (聽Fig聽.聽S4聽).聽Sin embargo, esto no tuvo impacto en la respuesta de las citoquinas (聽S4 Fig聽).聽Por lo tanto, la estructura alterada de la pared celular en estos mutantes afecta la fagocitosis, pero no es suficiente para afectar las respuestas de citocinas proinflamatorias.

La fagocitosis mejorada est谩 mediada por el reconocimiento de 尾-glucano por Dectin-1

El 尾-glucano es reconocido por el receptor de tipo lectina tipo C Dectin-1 [聽聽].聽Como el anticuerpo monoclonal anti-尾1,3-glucano espec铆fico confirm贸 que el crecimiento en condiciones 谩cidas dio como resultado el desenmascaramiento de 尾-glucano, se evalu贸 la accesibilidad de este 尾-glucano expuesto a Dectin-1.聽La tinci贸n inmunofluorescente de c茅lulas cultivadas con 谩cido usando Fc-Dectin-1 confirm贸 que la Dectina-1 se une m谩s f谩cilmente a las c茅lulas cultivadas en condiciones 谩cidas (聽Fig. 10A聽).聽Para determinar si esta uni贸n mejorada de Dectin-1 a la superficie de las c茅lulas cultivadas con 谩cido dio como resultado un aumento de la tasa de fagocitosis, se expres贸 Dectin-1 en la superficie de los fibroblastos.聽Los fibroblastos que expresan Dectin-1 m谩s unido f谩cilmente聽C聽.聽c茅lulas de聽albicans聽cultivadas en condiciones 谩cidas que las c茅lulas cultivadas con YPD o pH8 (Fig. 10B聽).聽No se observ贸 adhesi贸n mejorada en fibroblastos que no expresaban Dectin-1, y podr铆an bloquearse usando fosfato de glucano (Fig. 10C聽), confirmando que la adhesi贸n mejorada se debe a una interacci贸n espec铆fica entre Dectin-1 y 尾-glucano expuesto a la superficie, y no debido a diferencias en las propiedades electroqu铆micas de la pared celular.

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El reconocimiento inmunitario mejorado de c茅lulas adaptadas 谩cidas est谩 mediado por Dectin-1.

a)聽Uni贸n de Fc-Dectina-1 al tipo聽C聽salvaje聽.聽las聽c茅lulas de聽albicans聽crecidas hasta la fase de registro medio en YPD amortiguadas al pH apropiado, tal como se cuantifica mediante FACS contando 10,000 eventos por repetici贸n.聽El aumento de pliegue es relativo al YPD sin b煤fer.聽b)聽C聽.聽Albicans聽se cultiv贸 en YPD al pH apropiado para la fase de registro medio, se incub贸 conjuntamente con fibroblastos durante 1 h, se fij贸 y se determin贸 el 铆ndice de asociaci贸n (n煤mero de c茅lulas f煤ngicas unidas y fagocitadas / 100 macr贸fagos).聽c)Asociaci贸n de 谩cidos聽C聽adaptados聽.聽c茅lulas de聽albicans聽a fibroblastos que expresan Dectin-1 en presencia de fosfato de glucano.聽re)Macr贸fagos J774.1A se pre-incubaron con fosfato glucano y se infectaron con聽C聽.聽albicans聽con un MOI de 5 y el 铆ndice de fagocitosis (n煤mero de c茅lulas f煤ngicas fagocitadas / 100 macr贸fagos) determinado despu茅s de 1 h.聽e)聽los macr贸fagos J774.1A se pre-incubaron con fosfato glucano y se infectaron con聽C聽.聽albicans聽con un MOI de 5 y el 铆ndice de asociaci贸n determinado despu茅s de 1 h.聽Los datos representan la media 卤 SEM de tres repeticiones independientes (* p> 0.05. *** p> 0.001).

Para confirmar a煤n m谩s el papel de la Dectina-1, el receptor de Dectina-1 se bloque贸 con fosfato de glucano.聽El bloqueo de Dectin-1 en la l铆nea celular de macr贸fagos J774.1A, result贸 en una disminuci贸n dependiente del pH en la fagocitosis (聽Figura 10D聽), pero no afect贸 a la asociaci贸n de聽C聽.聽albicans聽con el macr贸fago, con c茅lulas adaptadas al 谩cido que todav铆a muestran una asociaci贸n mejorada (聽Fig. 10E聽).聽Por lo tanto, se requiere Dectin-1 para mejorar la fagocitosis, pero otros receptores de reconocimiento de patrones son responsables de la uni贸n inicial de聽C聽adaptada al 谩cido聽.聽albicans聽a la superficie de las c茅lulas inmunes innatas.

La adaptaci贸n al pH 谩cido da como resultado un mayor reclutamiento de c茅lulas inmunes聽in vivo

Evaluaci贸n de la respuesta inmune innata a 谩cido adaptada聽C聽.聽las聽c茅lulas de聽albicans聽confirmaron que el aumento de la exposici贸n al glucano produce una respuesta inmune proinflamatoria aumentada.聽Para investigar la聽in vivo聽importancia de este descubrimiento, vivir聽C聽.聽Se inyectaron c茅lulas de聽Albicansadaptadas a diferentes condiciones de pH en la cavidad peritoneal de ratones, y se determin贸 el reclutamiento de c茅lulas inmunes innatas despu茅s de 4 horas.聽C聽.聽albicans聽c茅lulas adaptadas a entornos 谩cidos reclutaron m谩s linfocitos CD45 + de聽C聽.聽c茅lulas de聽albicans聽adaptadas a pH6 (聽Fig. 11A, P = 0,007), incluyendo significativamente m谩s neutr贸filos que聽C聽.聽c茅lulas de聽albicans聽adaptadas a medios de pH6 (聽Fig. 11B聽, p = 0.010).聽Sin embargo, el an谩lisis de la poblaci贸n celular general confirm贸 que aunque el n煤mero total de c茅lulas inmunes reclutadas aument贸, no hubo diferencias significativas entre los porcentajes de cada tipo de c茅lula reclutada (聽Fig. 11C聽, p = 0.540).聽Por lo tanto,聽C聽.聽las聽c茅lulas de聽albicansadaptadas a ambientes 谩cidos inician una respuesta inmune innata proinflamatoria m谩s fuerte y reclutan significativamente m谩s c茅lulas inmunes al sitio de la infecci贸n.

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C聽.聽Las聽c茅lulas聽albicans聽adaptadas a ambientes 谩cidos reclutan m谩s c茅lulas inmunes innatas聽in vivo聽.

a)聽N煤mero total de CD45 +, CD11b + y Ly-6B.2 + (7/4 clon) c茅lulas (incluyendo monocitos y neutr贸filos) reclutados en la cavidad peritoneal despu茅s de 4 h de exposici贸n a聽C聽.聽albicans聽incubados en pH6 o pH4 YPD (p = 0.007).聽b)聽N煤mero total de neutr贸filos (identificados adicionalmente usando F4 / 80) reclutados en la cavidad peritoneal (p = 0.010)聽c)聽Porcentaje de neutr贸filos en la poblaci贸n total de c茅lulas inmunes innatas reclutadas (p = 0.540).

Discusi贸n

C聽.聽Albicans聽tiene una capacidad notable para responder y adaptarse a una multitud de se帽ales ambientales.聽Aqu铆, demostramos que la adaptaci贸n a los resultados de pH bajo en la remodelaci贸n significativa de la聽C聽.聽pared celular de聽albicans聽.聽Los efectos m谩s llamativos incluyen la eliminaci贸n de la capa de la quitina subyacente y el 尾-glucano.聽El desenmascaramiento de estos ep铆topos de carbohidratos subyacentes fue un proceso activo, y fue independiente de la p茅rdida de fosfomanano, lo que sugiere que la escisi贸n qu铆mica de este componente de la pared celular externa no agot贸 lo suficiente la armadura externa de manano como para revelar patrones moleculares asociados a pat贸genos internos (PAMP).

La quitina se remodela en la pared celular a trav茅s de las acciones de las quitinasas.聽C聽.聽albicans聽expresa cuatro quitinasas [聽聽], sin embargo, solo la eliminaci贸n de聽CHT2聽impidi贸 la聽eliminaci贸n de la聽quitinadependiente del pH.聽Cht2 se expresa principalmente en c茅lulas de levadura, y est谩 anclado en GPI a la pared celular [聽聽].聽El desenclavamiento dependiente del pH de la quitina de la pared celular tambi茅n depend铆a de los factores de transcripci贸n Rim101 y Bcr1.聽Rim101 se procesa en C-terminal en respuesta a ambientes alcalinos a trav茅s de la聽cascada de se帽alizaci贸n聽RIM101聽, y activa la expresi贸n de genes alcalinos inducidos, mientras reprime la transcripci贸n de genes inducidos por 谩cido [聽]聽Bcr1 es esencial para la formaci贸n de biopel铆culas y controla la expresi贸n de muchos genes asociados a la pared celular, incluidos聽HWP1聽,聽ALS1聽,聽ALS3聽e聽HYR1聽[聽聽].聽La expresi贸n de聽CHT2聽depend铆a de Bcr1, y mostr贸 una expresi贸n dependiente de pH de Rim101 en entornos por encima de pH6.聽Este aumento alcalino dependiente de la expresi贸n se perdi贸 en el聽mutante聽bcr1聽螖, lo que sugiere que Bcr1 es esencial para la聽expresi贸n de聽CHT2聽, como se indica en los an谩lisis transcript贸micos a gran escala [聽聽].聽Sin embargo, Bcr1 tambi茅n regula positivamente聽RIM8聽[聽聽], lo que sugiere que la inactivaci贸n de聽BCR1Tambi茅n disminuir铆a el procesamiento de Rim101, uniendo las dos v铆as (聽Fig. 12A聽).

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Regulaci贸n de la remodelaci贸n de la pared celular durante la adaptaci贸n al pH ambiental.

a)聽En entornos por encima de pH 5.5, la ruta Rim101 se activa dando como resultado el procesamiento C-terminal de Rim101 y mejorar la expresi贸n de聽CHT2聽.聽El complejo She3 luego transporta聽ARNm de聽CHT2聽a la pared celular, donde se traduce y se une a trav茅s de su ancla GPI.聽A pH 4, Rim101 no est谩 activado, lo que resulta en una expresi贸n reducida de Cht2.聽b) (i)聽Cuando est谩 presente en la pared celular (es decir, por encima de pH 5.5), Cht2 hidroliza el pol铆mero de quitina en crecimiento en fragmentos m谩s cortos que pueden unirse por hidr贸geno y formar microfibrillas de quitina cortas que est谩n incrustadas profundamente dentro de la pared celular.聽(ii)Cuando hay cantidades reducidas de Cht2 en la pared celular (es decir, entornos por debajo de pH 4), el pol铆mero de quitina en crecimiento se escinde de manera menos eficiente, lo que resulta en la incorporaci贸n de pol铆meros de quitina m谩s largos que est谩n m谩s expuestos en la superficie exterior de la pared celular.

Una hip贸tesis para el desenmascaramiento de la quitina es que durante el crecimiento en ambientes neutros o alcalinos, Rim101 y Bcr1 activan la expresi贸n de聽CHT2聽.聽She3 luego entrega聽ARNm de聽CHT2聽a la pared celular, donde se traduce y se incorpora a la pared celular a trav茅s de su ancla GPI.聽Se predice que Cht2 posee actividad endo-quitinasa.聽Por lo tanto, una vez en la pared celular, Cht2 actuar铆a internamente en las microfibrillas de quitina, disminuyendo su longitud y permitiendo la incorporaci贸n correcta en la capa interna de la pared celular.聽Sin embargo, durante el crecimiento en condiciones 谩cidas, Rim101 est谩 inactivo, lo que resulta en niveles transcripcionales m谩s bajos de聽CHT2y otras enzimas reguladoras de la pared celular.聽En este caso, habr谩 menos Cht2 para actuar sobre las microfibrillas de quitina, lo que puede aumentar la longitud de estas microfibrillas, dificultando su incrustaci贸n en la capa interna de la pared celular y resultando en una mayor exposici贸n de quitina en la superficie celular (聽Fig. 12B聽)

M谩s sorprendente que el desenmascarado de la quitina fue el desenmascaramiento del PAMP altamente proinflamatorio, el 尾-glucano.聽La disecci贸n de las v铆as clave que se sabe que est谩n involucradas en la regulaci贸n de la bios铆ntesis de la pared celular y la detecci贸n del pH sugiri贸 que estas v铆as convencionales no son responsables de regular el cambio en la distribuci贸n de 尾-glucano.聽En聽S聽.聽cerevisiae聽, la adaptaci贸n a ambientes 谩cidos tiene efectos opuestos que inducen el enmascaramiento de 尾-glucano, que est谩 mediado por la v铆a de transducci贸n de se帽ales Hog1 [聽聽].聽Supresi贸n de聽HOG1聽no tuvo impacto en desenmascaramiento 尾-glucano en聽C聽.聽albicans聽, lo que sugiere que se ha producido significativa recableado transcripcional durante la evoluci贸n entre聽S聽.cerevisiae聽y聽C聽.聽albicans聽.

C聽.聽albicans聽se aisl贸 a partir de 95% de los casos de candidiasis vulvovaginal (VVC), con el 5% restante de infecciones est谩 causada principalmente por聽C聽.聽glabrata聽[聽聽].聽Durante la colonizaci贸n de la mucosa vaginal聽C聽.聽albicans聽est谩 expuesto a muchas condiciones ambientales, incluido un pH bajo de la mucosa (pH vaginal = 3.5-4.5).聽A diferencia de la vaginosis bacteriana, que est谩 asociada con la alcalinizaci贸n de la mucosa vaginal, durante el VVC, el pH de la mucosa permanece bajo [聽聽].聽Por lo tanto, tanto durante la colonizaci贸n e infecci贸n de la mucosa vaginal,聽C聽.聽albicans聽est谩 expuesto a condiciones 谩cidas.

El desenmascaramiento dependiente del pH de la pared celular da como resultado un reclutamiento mejorado de c茅lulas inmunes innatas聽in vivo聽, lo que se correlaciona con una producci贸n mejorada de citocinas proinflamatorias.聽Nuestros聽ensayos聽in聽vitro confirman que este reconocimiento inmune mejorado fue mediado a trav茅s de la lectina de tipo C, como el receptor Dectin-1, un receptor dominante en la inmunidad innata f煤ngica conocida por reconocer el 尾-glucano [聽聽].

Colonizaci贸n vaginal sintom谩tica por聽C聽.聽los聽resultados de聽albicans聽en la migraci贸n excesiva de neutr贸filos, con secreciones vaginales que muestran un potencial quimiot谩ctico mejorado y un mayor da帽o a la mucosa [聽聽].聽El agotamiento de neutr贸filos reduce la inflamaci贸n y los s铆ntomas asociados con VVC [聽聽], lo que sugiere que el reclutamiento de neutr贸filos en VVC no es protector, en contraste con la candidiasis oral donde el reclutamiento de neutr贸filos y la activaci贸n de las respuestas Th17 son protectores [聽聽].

Crecimiento de聽C聽.聽albicans聽en VSM (un medio que se parec铆a m谩s al fluido vaginal) confirm贸 que el desenmascaramiento de 尾-glucano no es espec铆fico del medio, sino que depende del pH, y el desenmascaramiento solo ocurre a pH 谩cido.聽Esto plantea preguntas sobre el v铆nculo entre el desenmascaramiento de 尾-glucano y VVC, ya que los modelos de VVC de rat贸n, que provocan inmunopatolog铆as similares a las muestras humanas, tienen un pH vaginal neutro, no 谩cido, [聽聽].聽Aunque los modelos de mouse pueden replicar algunas condiciones experimentadas durante VVC, estos todav铆a no proporcionan un modelo completo de VVC.聽Por ejemplo, los ratones no son naturalmente colonizadas por聽C聽.聽albicansen el tracto vaginal, y normalmente est谩n inmunodeprimidos con estr贸genos para mantener la colonizaci贸n y es poco probable que el alto in贸culo utilizado para establecer la infecci贸n refleje cargas f煤ngicas durante el inicio de la VVC [聽聽].聽Las c茅lulas utilizadas para la inoculaci贸n intravaginal tambi茅n ser谩n inmunog茅nicamente diferentes a las adquiridas del tracto GI o la piel, que es la fuente principal de siembra vaginal en VVC humano.聽Finalmente, el pH neutro de la mucosa vaginal de rat贸n favorecer铆a el desarrollo de hifas r谩pida de聽C聽.聽albicans聽, que activar谩 la v铆a del inflamasoma m谩s r谩pidamente, lo que aumentar谩 la activaci贸n epitelial y la secreci贸n de citocinas proinflamatorias [聽]聽Por lo tanto, aunque el modelo de rat贸n es paralelo a los s铆ntomas de la CVV humana, todav铆a sabemos si la inmunopatolog铆a observada surge del mismo mecanismo subyacente.聽Por ejemplo, recientemente se ha informado que los neutr贸filos tambi茅n promueven el enmascaramiento de 尾-glucano [聽], lo que tambi茅n aumentar铆a la inflamaci贸n.聽Por lo tanto, aunque tenemos modelos animales para VVC, actualmente no reflejan directamente la infecci贸n humana.聽Es concebible que en el VVC humano, un aumento gradual de la carga f煤ngica en combinaci贸n con el enmascaramiento dependiente del pH del 尾-glucano inmunoestimulador en las c茅lulas de levadura y hifas, como respuesta a los cambios ambientales dentro del nicho vaginal, podr铆a iniciar un proceso m谩s temprano. respuesta de citocina proinflamatoria m谩s fuerte, lo que resulta en un mayor reclutamiento de neutr贸filos que causa colonizaci贸n vaginal sintom谩tica.

Referencias

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5456412/

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